protocol 分享｜DNA 定点突变
简介
基因定点突变是指向目的 DNA 片段中插入、缺失或点突变一个或多个碱基以改变基因的序列，进而突变某个氨基酸。
用途
基因定点突变常用于基因研究，该方法能快速、高效提高目的蛋白的性状和表征，以便于研究目蛋白的结构及功能特性。
材料与仪器
一、同源重组法
（南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒）
材料：诺唯赞 Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒、ddH2O、PCR 管、感受态细胞、PCR 仪、摇床等
二、一管式突变试剂盒
一管式突变试剂盒的使用方法比较简单，不需要重组环化大的过程，真的一管就可以实现环状质粒的突变。
材料：一管式突变试剂盒、ddH2O、PCR 管、感受态细胞、PCR 仪、摇床等
步骤
一、同源重组法
①突变引物设计
引物设计的原理是选择包括突变位点在内的15-21bp互补片段，然后在两段再选择至少15bp非互补片段。反向互补区域GC含量40%～60%为佳，且应该避免选择有重复序列的区域。
②目标质粒扩增
在①中获得的引物按照如下反应体系扩增，其中Phanta为一种DNA聚合酶。
推荐使用 ≤1 ng新鲜提取的质粒作模板，需要将质粒稀释较大的倍数才可以得到这么低的模板浓度。在如上所述50ul反应体系中，ddH2O与质粒的总体积为19ul。
推荐PCR反应条件如下。退火温度一般设置为引物Tm值。为避免引入非目标突变，扩增数应小于35，若扩增效率良好，扩增数最好小于30。
反应结束后，可取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如目标质粒条带单一且位于正确位置，则可认为扩增成功，可进行下步实验。
③扩增产物Dpn I 消化
因②中扩增产物含有原始模板质粒，需要在进行重组环化之前将其消化，去除甲基化模板质粒（原理：模板质粒来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而通过 PCR 扩增的质粒则不含有甲基化修饰。甲基化酶Dpn I酶可以消化掉质粒模板而不消化PCR生成的产物。这也要求我们必须使用甲基化酶无缺陷的宿主菌扩增原始质粒，如XL10、DH5α、JM109）。
向40-50ul②中反应产物中加入1ulDpn I酶，轻轻吸打混匀，短暂离心，置于37℃恒温反应1 - 2 h。
④消化产物用量
对于单碱基突变，Dpn I消化产物最适使用量 = [0.02 × 片段碱基对数] ng
⑤重组反应
对于单碱基突变，推荐以下反应体系：
使用移液器将上述物质轻轻吸打混匀(勿涡旋振荡！)，短暂离心，将反应液收集至管底。 37℃，30 min，然后立即置于冰上冷却。
注意：
反应体系应在冰上配置；
扩增模板量过高或Dpn I 消化不完全易造成较高的假阳性背景，因此推荐设置阴性对照。
⑥重组产物转化
在冰上解冻克隆感受态细胞，取 10 μl 重组产物加入到 100 μl 感受态细胞中，轻弹管壁混匀(勿涡旋振荡！)；
冰上静置 30min，随即 42℃ 水浴热激 45sec，再立即置于冰上冷却 2～3min。
用无菌涂布棒将菌液在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。37℃ 培养箱中倒置培养 12～16h；
若重组反应转化平板上的克隆数目显著高于阴性对照，可挑取若干个单克隆接种至含有适当抗生素的 LB 液体培养基中培养过夜，提取质粒进行一代测序。
二、一管式突变试剂盒
①引物设计：同上
②目标质粒扩增（25ul 体系）
根据试剂盒具体要求，添加适当体积及浓度的各种物质。扩增循环数、扩增速度等可参考「同源重组」法。
③扩增产物Dpn I 消化
同「同源重组」法。
④重组产物转化
同上述⑥
注意事项
点突变的操作很简单，一般第一次上手就能成！
需要注意所加的物质比较多，比如加样后瞬时离心将物质离心到管底，以及冰上保存的试剂不要放在室温保存。
目标质粒扩增所需要的模板量非常小，一定不要加多了。
常见问题
如果同源重组法的步骤②中的条带具有非特异性，可以根据 marker 的位置进行胶回收，再进行后续的实验
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最后编辑于 2023-05-06 · 浏览 974
