关于使用三氯醋酸沉淀法，如何解决蛋白质难于重悬？
Q：关于使用三氯醋酸沉淀法，如何解决蛋白质难于重悬？
A1：考虑是体系中脂类\酚类杂质较少，所以三氯醋酸没办法实施重悬，可以考虑离心沉淀
A2：以下是一些可能的解决方案：
增加重悬缓冲液的含量：将重悬缓冲液的体积增加，可以减少蛋白质在溶液中的浓度，有利于重悬。通常，可以将重悬缓冲液的体积增加到蛋白质沉淀物的5-10倍。
增加重悬缓冲液中的蛋白质还原剂：将重悬缓冲液中的蛋白质还原剂浓度增加，有助于蛋白质的还原和重悬。常用的蛋白质还原剂包括二巯基乙醇（DTE）和二巯基丙酸（DTT）等。
增加重悬缓冲液的pH值：增加重悬缓冲液的pH值可以改变蛋白质的电荷性质，有助于重悬。通常，可以将pH值调整到7.5-8.5左右。
增加重悬缓冲液的混合时间和温度：在重悬缓冲液中加入蛋白质沉淀物后，可以通过增加混合时间和温度，有助于蛋白质的重悬和溶解。一般来说，可以在37℃下轻轻摇晃或震荡样品30分钟到1小时。
使用超声波：对于难于重悬的蛋白质样品，可以使用超声波来帮助重悬。超声波能够破碎样品中的蛋白质聚集体，有助于蛋白质的溶解。需要注意的是，超声波的使用需要注意功率、时间和距离等参数。
Q：怎样保存2-D凝胶？？
A1：2-D凝胶通常在4度保存,置于密封之塑料袋中,可以加入10%的乙醇或1%的冰乙酸中,4度,一般放2周-1个月没什么问题。
A2：以下是几种常用的2-D凝胶保存方法：
低温保存：2-D凝胶可以在4℃下保存，但需要注意避光，以免蛋白质被光照射而分解。此外，应避免凝胶受到震动和振荡。
冷冻保存：2-D凝胶可以在-20℃或更低的温度下保存，可以延长凝胶的保存时间。在保存前，需要将凝胶完全干燥，以避免在低温下出现冰晶化破坏凝胶。
冷冻干燥保存：2-D凝胶可以通过冷冻干燥的方法进行保存。首先将凝胶在常温下晾干，然后放入冷冻干燥机中进行干燥，最后存放在干燥器中。这种方法可以延长凝胶的保存时间，但需要专业的设备和技术支持。
切片保存：对于大型的2-D凝胶，可以将其切成若干小块进行保存。每块凝胶应该先进行充分的洗涤和去除背景染色，然后用干净的滤纸包裹，并放入密闭的袋子或盒子中保存。
Q：酵母双杂酵母双杂转入ad/bd质粒（作为阴性对照）后二缺板可以生长，在四缺板上也可以生长，是什么原因呀
A1：二缺培养基：此类酵母SC选择培养基－SD培养基用于双质粒酵母转化筛选。四缺培养基：此类酵母SC选择培养基－SD培养基主要用于报告基因分析。酵母双杂转入质粒后两者均可生长说明混有杂质。
A2：如果酵母双杂转入了AD/BD质粒，但在二缺板和四缺板上均可以生长，可能是因为所使用的培养基不同或者酵母双杂的菌株具有一些非特异性交互作用，导致假阳性的结果。
一般来说，在二缺和四缺培养基上，酵母双杂只有在正常表达被检测蛋白质的条件下才能生长。在二缺培养基上，只有酵母双杂在同时表达Leu2和Trp1基因才能生长。在四缺培养基上，只有酵母双杂在同时表达Leu2、Trp1、His3和Ade2基因才能生长。因此，如果在二缺板和四缺板上都可以生长，可能是因为该菌株具有非特异性的基因表达，导致在缺失某些氨基酸合成途径所需的基因时，仍能生长。
此外，如果质粒没有转入酵母感受态，也可能会出现生长的情况。这可能是因为某些非特异性交互作用或者污染导致的假阳性结果。
A3：说明转入的两个蛋白能互作，报告基因被激活，所以能在三缺或四缺板子上生长，如果不能互作，就不生长
Q：免疫共沉淀实验，用裂解液裂解细胞后的液体非常粘稠，离心后也非常粘稠，用2.5微升枪头也没办法吸取上清，怎么办？
A1：建议增加裂解时间，或者增加一种裂解酶。
A2：如果进行免疫共沉淀实验时，裂解液非常粘稠，可能是因为细胞裂解不彻底或者存在大量的DNA或RNA等高分子物质，导致样品粘稠。这种情况下，可以尝试以下几种方法：
1.调整细胞裂解条件：可以尝试更改裂解液的pH值、NaCl浓度、甘油浓度、Triton X-100浓度、EDTA浓度等条件，以优化细胞裂解效果。如果使用冷冻切割法等机械方法裂解细胞，则需要对样品制备过程进行优化。
2.增加离心时间或速度：可以将样品离心时间或速度增加，以使高分子物质沉淀到底部，上清变得更加清晰。
3.使用更细的过滤器：如果上清液中存在较多杂质或大分子物质，则可以使用更细的过滤器，如0.22微米的滤器，将样品过滤后再进行吸取。
4.使用更精细的吸头：可以使用更细的吸头，如1微升的吸头，将样品吸取到新的离心管中，避免样品残留在原有的离心管中。
需要注意的是，在进行免疫共沉淀实验前，应该对细胞裂解条件进行优化，并进行充分的离心和过滤操作，以避免实验结果的偏差。
A3：粘稠的物质是核酸成分，可以通过以下方法可以减少粘稠：选择较为温和的裂解液，适当增加裂解液的量
Q：为什么包病毒收的上清液很黄，但是离心完的上清液很红？包病毒实验：48h和72h收上来的上清液都很黄，而且一共加了7ml病毒浓缩液，但是为什么离心完的上清液很红，像血清一样，而且病毒沉淀很少，只有底下浅浅一层，大概2-3mm厚？
A1：黄色的上清液可能是由于胆固醇等脂质类物质或者其他代谢产物的积累导致的。如果在48h和72h收上清液时都出现了这种情况，可能与细胞类型和病毒载体有关。
至于上清液离心后呈现红色，并且病毒沉淀很少，这可能是由于以下原因：
剩余血清的影响：如果病毒载体中残留了较多的血清成分，在病毒沉淀时可能会与病毒一起沉淀下来，从而使上清液呈现出红色。此外，血清的蛋白质和其它成分可能会干扰病毒的沉淀和浓缩。
病毒的沉淀能力：如果病毒的沉淀能力较弱，可能会导致病毒沉淀的少，形成的沉淀层较浅，从而使上清液呈现出红色。
A2：这个是正常的，病毒液的颜色主要是受PH影响，细胞消耗培养基成分以及培养箱中的二氧化碳都会使培养基变黄，收完之后离开了那个环境就会变红。
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最后编辑于 2023-05-05 · 浏览 1047
