外泌出细胞的蛋白如何验证
Q：请问有大佬知道外泌出来的蛋白如何验证么？是真菌的孢子外泌出来一种蛋白，老师说通过细胞培养的上清液做WB，不知道细节该如何做。这几天已经试了一下，但是WB结果什么都没有。在线请求大佬指导一下。
A1：首先外泌体蛋白的鉴定方法有很种，包括有western blot、ELISA、流式细胞术和质谱技术等。其中，WB、ELISA和流式细胞术主要可以用来鉴定外泌体膜蛋白和外泌体的标志蛋白以及它们的表达情况。质谱除了可以用于外泌体已知蛋白的鉴定，还可以用于未知蛋白的鉴定，尤其可以用于外泌体蛋白组学的研究中。
其次wb鉴定外泌体蛋白和基础wb步骤类似，不出结果可以考虑蛋白是否提取准确，是否存在污染变性等情况
A2：验证外泌出的蛋白质通常可以通过以下步骤进行：
收集上清液：将真菌孢子培养在适当的培养基上，培养至一定时间后，收集上清液。上清液中可能包含孢子释放出的外泌物蛋白质。
蛋白质提取：将收集的上清液进行蛋白质提取。通常可以使用酸性异丙醇沉淀法、超声波法、直接浸泡法等方法进行蛋白质提取。
蛋白质分离：将提取的蛋白质进行分离。可以使用SDS-PAGE、2D-PAGE等电泳技术进行分离。
免疫检测：使用Western blot等免疫检测技术，检测目标蛋白质是否存在。具体来说，将分离的蛋白质电泳转移至聚丙烯酰胺膜上，然后用特异性抗体进行探针探测。
如果您的实验结果没有发现目标蛋白，可能需要检查实验的条件和方法是否正确。例如，是否使用了特异性高的抗体、是否进行了充分的蛋白质提取、是否选择了合适的检测时间和条件等等。如果实验方法和条件都已经经过了充分的优化和验证，仍然无法检测到目标蛋白，可能需要进一步考虑其他验证方法，例如质谱分析、ELISA等技术。
Q：敲降某甲基化转移酶以后，wb显示组蛋白H3K27me3和H3K4me3的水平不发生变化，请问是需要对细胞做什么处理再跑wb吗？
A1：应该采用激动剂刺激之后再去检测下游蛋白的变化
Q：过去三个月用elisa测了4个因子，每次的结果我都只是拍照保存，没有导出文件。这样可以作为原始数据吗？
A1：一般来说ELisa不要求原始数据，应该没问题
A2：这要看你到时候投稿的杂志，如果杂志社要求原始数据的话，光拍照是不够的。
A3：拍照保存的ELISA结果可以作为原始数据的一部分，但建议您尽快将这些结果导出成数字化格式，如Excel文件等。这样可以方便您对数据进行进一步的分析和统计，也可以减少数据的误差和主观性。
如果您没有保存数字化的ELISA结果文件，您仍然可以使用拍照保存的结果进行数据分析。但需要注意的是，对于一些需要精确量化的数据分析，如计算浓度或比率等，使用数字化结果更加准确和可靠。另外，如果您计划在发表论文或申请专利时使用这些数据，建议您确保您的数据保存符合科学研究的规范和要求，以免给后续的数据分析和复现实验带来困难。
Q：请问真菌培养液中孢子分泌出来的蛋白如何提取？请问有大神能够帮忙指导给个建议或者方法么？
A1：可以使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取真菌孢子分泌的蛋白质。
A2：酚抽提法
1 在液氮中将 1g 菌体研磨为粉末
2 加入 6 ml 水饱和酚（buffer-saturated phenol）和 2 ml提取液（20mMTris-Cl, pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (v/v), 0.5M EDTA, pH 7.5, pH 8.0,0.07% β－巯基乙醇, protease inhibitors）。
3 在4度混合30分钟。
4 12000 rmp 离心1min，使两相分开。
5 弃沉淀，吸取上层的苯酚相，加入5倍体积的冷丙酮，-20度沉降2h。
6 12000 rmp，4度，离心15分钟沉淀蛋白，弃去上清。
7 沉淀干燥至丙酮挥发完全。
A3：真菌孢子分泌出来的蛋白质通常可以通过以下步骤进行提取：
收集和清洗孢子：将真菌培养液离心，收集并用PBS等缓冲液清洗孢子，以去除残留的培养液和其它杂质。
孢子破碎：将清洗后的孢子在液氮中冷冻并研磨成粉末，或使用高压均质器等设备将孢子破碎，释放出孢子内部的蛋白质。
提取蛋白质：将孢子粉末或破碎后的孢子用适当的缓冲液或提取剂进行提取。常用的蛋白质提取方法包括直接浸泡法、超声波法、异丙醇沉淀法、酸性异丙醇沉淀法、硫酸铵沉淀法等等。
蛋白质分离和纯化：根据需要，可以对提取的蛋白质进行分离和纯化。例如，可以使用离心分离、柱层析、电泳等技术来纯化目标蛋白。
Q：包装好的慢病毒感染THP1后，细胞要么贴壁要么抱团，荧光效率也很低，到底应该怎么做？
A1：以下是一些建议，以改善感染效果：
调整MOI（Multiplicity of Infection，感染倍数）：尝试使用不同的MOI对THP-1细胞进行感染，以确定最佳感染效果。在实验初期，可以进行MOI梯度实验，以观察细胞在不同MOI下的生长和感染效果。选择最佳感染效果且对细胞生长影响最小的MOI进行后续实验。
使用增强感染试剂：可以使用一些增强感染试剂（如Polybrene）来提高感染效率。请注意，使用增强感染试剂时需要注意浓度的选择，以防对细胞产生毒性。
调整病毒接触时间：增加病毒与细胞接触的时间，以提高感染效率。通常情况下，慢病毒感染时间为4-8小时，但可以尝试将感染时间延长至12小时或更长时间，以观察感染效果的变化。
改变培养条件：对于贴壁和抱团问题，可以尝试改变培养条件。添加更多的培养基，以减少细胞间的接触，从而降低细胞贴壁和抱团现象。另外，可以使用非粘附的培养容器，以防止细胞贴壁。
适当使用离心：感染过程中，轻轻离心以促进细胞与病毒的接触。但请注意，离心过程中应使用适当的离心速度和时间，以防止对细胞造成损伤。
检查病毒包装和滴度：确保病毒包装和滴度合适。使用低滴度的病毒可能导致感染效率低。此外，检查病毒在储存和运输过程中是否遭受损失。
优化荧光检测时间：感染后，细胞可能需要一定的时间来表达荧光蛋白。请尝试在不同的时间点检测荧光信号，以确定最佳检测时间。
A2：慢病毒会对THP1细胞造成一定的毒性，不同细胞对毒性的耐受力不同。建议调整并降低感染时使用的 MOl 值，即可在细胞准备时增加铺板细胞的融合率（可提高至 70%），调整感染时加入的病毒量。此外，还可选择在感染 4 小时后换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。
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最后编辑于 2023-04-25 · 浏览 1261
