CTAB 提取真菌DNA实验中，CTAB 加入到真菌以后为什么要 65 度水浴？
Q：CTAB 提取真菌DNA实验中，CTAB 加入到真菌以后为什么要 65 度水浴？
A1：65度水浴可以使体系中大多数酶失效，达到提纯dna的作用。另外水浴还可以使dna保持最佳状态有利于后续实验
A2：避免CTAB和SDS在低温的结晶析出，有利于植物组织中DNA的溶解，同时也有利于破坏细胞裂解后的大多数的DNA酶组分，让酶蛋白高温变性失活。
A3：这是因为，CTAB能够结合到DNA的负电荷上，从而使DNA脱离细胞质和蛋白质等杂质，形成一种CTAB-DNA复合物。热处理可以加速CTAB-DNA复合物的形成，从而加强DNA的提取效果。
此外，65℃水浴也有助于裂解真菌细胞壁和细胞膜，使DNA更容易被CTAB和其他化学试剂提取出来。
Q：想求助一下，我用EDC/NHS活化法将抗体偶联到荧光微球上，想测试一下有没有偶联成功，将划好的NC膜底端插入偶联好的荧光微球溶液中，一开始一条线都没有，过了半小时左右C线才开始明显，当我把它做成免疫层析试纸条再测试的时候还是一条线都没有，这种情况是这么回事，抗体和荧光微球有没有偶联成功呢
A1：没有偶联成功，偶联成功的话在测试的时候就会有条带，不需要等太久。
Q：做定点突变，第一步中，目标质粒扩增，扩增的是质粒中的目的片段还是质粒载体+目的片段
A1：用点突变的序列引物做全长扩增，包括正反向，得到的是含点突变的质粒载体
A2：后者，扩征的是质粒载体加目的片段
A3：在做定点突变的第一步中，我们需要对目标质粒进行扩增。扩增的是整个质粒，包括质粒载体和目的片段。通过PCR扩增，我们可以获得大量的质粒DNA。在后续步骤中，我们会引入定点突变，然后将突变的质粒进行转化、筛选和鉴定。
Q：外周血样本进行单细胞测序，如何保持样本活性最大，取样过程应注意什么？
A1：进行单细胞测序需要采集外周血细胞样本，并且在样本采集和处理过程中，保持细胞活性和完整性是非常重要的。以下是一些关于如何保持样本活性最大和取样过程应注意的建议：
1.采集新鲜样本：尽可能采集新鲜的血液样本，避免长时间存放或运输，这会降低细胞的活性和完整性。
2.使用无菌技术：在取样和处理样本的过程中，应该使用无菌技术，避免任何细菌或病毒污染样本。
3.使用合适的抗凝剂：血液样本在采集后需要立即加入合适的抗凝剂，如EDTA或肝素，以防止血液凝固，维持细胞的完整性。
4.保持低温：在取样和运输过程中，应该保持样本的低温，以防止细胞失活。一般建议在4℃以下保存样本，并在24小时内处理。
5.快速处理样本：在样本采集后，应该尽快进行单细胞分离和测序处理，以最大限度地保持细胞的活性和完整性。
6.注意离心速度和时间：在进行单细胞分离时，应该注意离心速度和时间，以防止细胞损伤或失活。
A2：取样过程应注意：
1.采集管抗凝剂：EDTA
2. 按照外周血标准采集操作进行，取受检者（成人）不低于5 mL外周血，分装2管；取受检者（婴幼儿）不低于2mL外周血；完毕后，充分颠倒混匀，避免凝固。
3. 采集后如即刻寄送，可常温运输（需保证2 天内送达实验室）；如有条件建议冰袋/干冰运输，以避免细胞死亡降解。新鲜外周血寄送前可短期保存在4℃或-20℃，长期应保存于-80℃。冻存的外周血，需在-20℃保存，保存时间不超过2年，反复冻融不超过5 次，需冰袋/干冰运输。
A3：针对于外周血样本，在取样过程中应注意：①外周血（全血）样本取样时需置于EDTA抗凝管中；
②采血管无破损，血液离体后不超过48h，EDTA 抗凝管没有过期，全血体积≥5mL，样本无严重溶血、无血凝块；
③在样本量充足的情况下，可以多设置1-2组重复；
④在寄送装有血液的抗凝管时，需用泡沫包裹，保证4℃左右的低温环境；⑤2-8℃条件下暂存及运输。
Q：长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，在引物设计阶段如何避免。
A1：引物设计没办法避开中间序列的错配或者突变，只能设计尽量好结合、相对特异的引物序列，使用高保真pcr酶可以降低突变概率
A2：在引物设计阶段，可以考虑以下几点：
引物长度一般为15-27 bp，最适为18-22 bp。
引物的GC含量应该在40%-60%之间，且应该避免出现连续的GC或AT。
引物的Tm值应该相同，且应该在55℃-65℃之间。
引物的3’端应该避免出现连续的G或C，以避免形成二聚体。
引物的5’端应该避免出现连续的A或T，以避免形成非特异性扩增产物。
引物的特异性可以通过BLAST等工具进行检验。
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最后编辑于 2023-04-24 · 浏览 1443
