trizol 法怎么提取血中 rna ？
Q：trizol 法怎么提取血中 rna ？
A1：trizol提取rna步骤：
1. 取血液2-5ml，4℃，离心2 min，去掉上清液体。
3. 在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；
4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；
5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心5分钟，弃上清；
6. 让沉淀的RNA在室温在自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
A2：以下是Trizol法提取血液RNA的步骤：
- 提取血液细胞
2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。
4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）
A3：使用TRIzol法提取血液中的RNA需要经过几个关键步骤。以下是简要的操作步骤：
1.采集血样：
首先，采集足够数量的血液样本。常见的体积是200至500微升，但实际需要根据实验目的和设计调整。
2.混合与溶解红细胞：
将血液样本加入到等体积的红细胞溶解液中（例如，10倍稀释的红细胞溶解液），充分混匀。静置5-10分钟，以使红细胞充分破裂和溶解。这一步是为了去除红细胞中的大量蛋白质和其他污染物。
3.离心：
将混合物离心（约300-400 x g，4°C，5-10分钟），收集上清液中的白细胞。弃去下层的红细胞沉淀。
4.洗涤与离心：
向收集到的白细胞上清液中加入等体积的PBS，充分混匀。再次离心（约300-400 x g，4°C，5-10分钟），弃去上清液，留下白细胞沉淀。
5.TRIzol裂解：
向白细胞沉淀中加入适量的TRIzol试剂（通常每100μL血液加入1mL TRIzol），充分混匀，使细胞充分裂解，释放RNA。静置5-10分钟，以确保充分裂解。
6.混合与分层：
向TRIzol裂解液中加入1/5体积的氯仿，充分混匀，然后静置2-3分钟。离心（约12,000 x g，4°C，15分钟），使混合物分为3层：上层是水相，中层是白色的蛋白质相，下层是有机相。
7.RNA沉淀：
转移上层水相到新的离心管中，避免触及中间相。向上层水相中加入等体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），充分混匀，使RNA沉淀。静置10-20分钟，以确保充分沉淀。
8.离心与洗涤：
将混合物离心（约12,000 x g，4°C，10-15分钟），以收集沉淀的RNA。
Q：使用毛细管制作芯片，制备双层液滴，芯片内相和中间相毛细管的尖端距离有什么讲究吗？我为什么做不出来呢，中间相可以剪切内相形成球，可是再同时打开外相时，就只能外相剪切中间相了，没有内层液滴
A1：以下是一些建议和注意事项，供您参考：
1.毛细管的尖端距离：
尖端距离需要适中，以保持液滴的稳定性并防止两个液滴之间的过早融合。通常，根据实验液相的流速和流动性，尖端距离可以在0.5至3 mm之间进行调整。建议先使用较大的距离开始尝试，并在实验中逐步调整以获得最佳结果。
2.调整流速：
在进行液滴制备时，内外相和中间相的流速会影响液滴的形成。请确保内相和外相的流速适中，以使液滴能够在毛细管尖端正常形成。您可能需要尝试不同的流速组合，以找到适合您实验的最佳参数。
3.调整流体相容性：
在实验中，流体的相容性也会影响液滴的形成。检查内外相和中间相的界面张力，确保内外相之间的界面张力足够大，以使液滴能够正常形成。如果必要，您可以更换其中一个相，以改善液滴形成效果。
4.保持稳定的操作条件：
确保在实验过程中，操作条件保持稳定。如室温、湿度、气压等都可能影响液滴的形成。此外，请确保使用的设备和毛细管在实验过程中始终保持清洁，以防止污染影响实验结果。
A2：尖端距离一般控制在1-5um左右成功率比较高
Q：小菜鸟最近在跑pcr，同一个样品想把errorbar跑低一点，但是跑了几次之后发现平台期越来越低，ct值却是正常的......网上看了一些图比如说是同一个样品重复90次啊这种的，发现人家的图的平台期也是高低不一的，这是为什么呢？求教，非常感谢
A1：PCR反应的平台期的高低受到许多因素的影响，包括PCR反应体系中的成分、放大区域、反应条件等等。在同一个样品内，重复跑PCR会有平台期高低不一的情况，这可能是由于样品的质量和含量的差异，反应条件的变化，PCR反应体系的变化等因素导致的。此外，error bar的大小也受到许多因素的影响，例如PCR反应的可重复性、PCR引物的设计、模板DNA的质量等等。因此，要使error bar变小，需要优化PCR反应条件、引物设计等方面的因素，以减少PCR反应的变异性。
A2：可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值。
Q：用人血做pcr，是用血浆还是全血还是血清比较好呢？
A1：我们一般都是用血清做的，直接采血然后取血清
A2：在进行PCR实验时，应该使用血浆或血清，而不是全血。这是因为全血中含有红细胞、白细胞和血小板等细胞成分，这些成分在PCR反应中会干扰PCR的效果，导致PCR失败。而血浆或血清则是去除了细胞成分的血液部分，可以用于PCR反应而不会干扰结果。在血浆和血清中，血浆中含有较高的DNA含量，因此在PCR反应中更为常用。但需要注意的是，在血浆或血清的提取过程中，要避免污染和破坏DNA分子，以保证PCR反应的准确性。
A3：全血里有gDNA，mtDNA，mRNA，lnc RNA，sRNA，r RNA，cfDNA，cfRNA等，检测mrna等成分一般用全血
Q：扩增1800bp左右cds区全长扩不出来，如果分段设计引物怎么弄？
A1：全长出不来就分开设计也可以啊，只要保证接口酶一致最后连接测序就可以了
A2：可以尝试分段设计引物来扩增。一般而言，可以根据CDS区域的序列信息，设计多对重叠的引物，将CDS区域分成较短的几段，每段长度不超过1000bp，然后逐段扩增。以下是一些分段扩增的建议：
确定CDS区域的边界。可以通过查阅文献、数据库或者基因注释信息等方式获取。
分段设计引物。选择多对引物，每对引物的长度应在18-24 bp之间，GC含量应在40-60%之间。引物的Tm值应该尽可能接近，以避免温度差异对PCR反应的影响。
确定引物的位置。可以在CDS区域的两端或者重叠区域设计引物。如果在CDS区域的两端设计引物，需要保证引物之间的距离不超过1000bp，否则可能会出现扩增失败的情况。如果在重叠区域设计引物，需要保证引物的重叠部分足够长，以确保引物的可靠性。
扩增每段CDS区域。将每一段CDS区域的引物按照标准的PCR反应体系进行扩增，然后进行凝胶电泳或者其他方法进行检测。
需要注意的是，分段扩增虽然可以解决整个CDS区域扩增失败的问题，但是也增加了PCR反应的复杂度和耗时。同时，由于引物设计不当或PCR反应条件不适宜等因素，分段扩增也可能会出现失败的情况。因此，在设计分段扩增方案时需要认真考虑引物的设计和反应条件的优化，以提高扩增成功率。
A3：分段设计的话如果不考虑CG 、 二聚体话,直接在CDS的上下游设计匹配的18-24bp的碱基作为引物即可PCR获得CDS
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最后编辑于 2023-04-23 · 浏览 3115
