综述 | 结核分枝杆菌DNA介导模式识别受体激活天然免疫机制的研究进展

文章来源：中国防痨杂志，2023，45(4): 426-433. 

doi: 10.19982/j.issn.1000-6621.20220399.

基金项目：国家自然科学基金 (81871691)；国家自然科学基金 (82272347)

作者：王文敬, 孙宏, 孙照刚 

作者单位：首都医科大学附属北京胸科医院转化医学研究室/北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室，北京 101149

通信作者:孙照刚，Email：sunzg75@163.com

摘要

结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 是引起机体发生结核感染的重大病原体。天然免疫在宿主抵抗MTB入侵过程中发挥了重要作用，机体细胞内的多种模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRR) 参与了针对MTB的识别。PRR作为天然免疫的“启动器”，在识别MTB后经过信号通路的转导激活天然免疫的产生。可被PRR识别的MTB组分种类繁多，包括：DNA、脂多糖、蛋白质等。本文重点关注可被PRR识别的MTB DNA，从其来源、可被识别的PRR种类，以及PRR以MTB DNA为病原相关分子模式介导相关分子信号通路激活天然免疫的机制3个方面综述了MTB DNA经由PRR激活天然免疫的过程，并着重探讨了Toll样受体9、环鸟苷酸-腺苷酸合成酶和黑色素瘤缺乏因子2样受体等PRR激活天然免疫机制的研究进展。最后，讨论了MTB DNA的应用前景，以期为开发MTB DNA相关疫苗和结核病的诊断拓展思路。

关键词： 分枝杆菌，结核；DNA; 受体，模式识别；免疫

当前，针对病原微生物的识别和后续天然免疫级联反应的研究备受关注。病原体 (病毒、细菌、真菌等) 入侵宿主会触发宿主的早期防御机制，激活宿主的天然免疫反应，生成干扰素 (interferon, IFN) 并激活后续获得性免疫反应 (如T细胞活化、抗体产生) 等。研究表明，已有多种模式识别受体可识别结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 组分。针对宿主抵抗MTB感染的免疫机制的研究显示，激活宿主天然免疫防御MTB的首要条件是识别出区别于宿主细胞本身的外源性MTB组分。天然免疫细胞的模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRR) 具有识别MTB病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) 包括脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)、蛋白质、核酸 (细菌DNA和RNA)、细菌多肽等MTB不同组分的生物学功能，在识别后激活天然免疫细胞内的信号级联反应，产生炎症因子和趋化因子，激活机体的免疫系统，招募更多的免疫细胞以抵抗MTB入侵。

外源病原体DNA的特异性识别在宿主早期抵御外源病原体感染和后续激活适应性免疫反应的过程中起着关键作用，识别宿主细胞内的MTB DNA为宿主防御MTB感染的基本机制。但目前关于MTB DNA被何种PRR识别及识别机制的研究仍有限。通过对识别MTB DNA的PRR种类的介绍及PRR识别MTB DNA并激活细胞天然免疫的机制进行综述，可以为结核病发病机制提供新的见解，并有助于开发有效的疫苗和疗法。

笔者介绍了被PRR识别的MTB DNA来源、多种可识别MTB DNA的PRR及MTB DNA介导PRR激活天然免疫的机制。通过以上三个方面的介绍，全面地总结了在MTB DNA方面免疫细胞可激活的PRR及相关分子信号通路，拓展了通过免疫手段来治疗MTB的思路，以期为天然免疫相关的抗结核治疗和MTB DNA疫苗研发提供新靶点和新方向。

一、PRR识别的MTB DNA来源

MTB中可被PRR识别的PAMP有多种类型，如蛋白、核酸、LPS等。其中，核酸又可分为DNA与RNA，在核酸作为PAMP被PRR识别的研究中，以识别MTB DNA的介绍更为广泛。

目前关于可以被识别的MTB DNA的来源不甚明确。研究表明，细胞内的MTB通过ESX-1分泌系统将MTB基因组DNA分泌到细胞质中并被相关PRR识别；MTB分泌外泌体内包裹DNA也已被证实，这可能也是激活PRR的MTB DNA的一种类型。另外，在MTB复制或被细胞溶解酶裂解的过程中，可能会在细胞内部产生一定的MTB DNA片段，并作为PAMP被PRR所识别。当这些可被PRR识别的MTB DNA进入体液当中，被统称为游离DNA，(cell free DNA,，cfDNA)，并常以70~200bp短片段或21kb长片段的DNA-蛋白质复合物形式存在。PRR识别的MTB DNA来源详见表1。了解PRR可识别的MTB DNA的类型有助于深入理解MTB DNA所引起的天然免疫的起因，有针对性地将结核病扼制于起始阶段，研究出治疗结核病更有效的药物。

二、可识别MTB DNA的PRR种类

PRR是机体先天免疫系统的重要组成部分，存在形式多样，不仅在细胞膜上表达，内膜、溶酶体膜和胞质中也同样分布广泛。PAMP是PRR的识别对象，除此以外，PRR还可以识别受损细胞释放的内源性分子，即损伤相关分子模式 (damage associated molecular patterns, DAMP)。由此可见 PRR在机体天然免疫的激活过程中居于十分重要的位置。

根据其位置 PRR被归类为膜结合或细胞质识别受体。Toll样受体 (Toll-like receptors, TLR) 和C型凝集素受体 (C-type lectin receptors, CLR) 能够感知细胞外病原体，是膜结合的，并且定位于质膜和内体；RIG-Ⅰ样受体 (retinoic acid-inducible gene-I like receptors, RLR)、NOD样受体 (nucleotide oligomerization domain like receptors, NLR)、黑色素瘤缺乏因子2 (absent in melanoma 2, AIM2) 样受体 (AIM2-like receptors, ALR) 和Pyrin定位于细胞的细胞质中，作为细胞内微生物、PAMP和DAMP的监视分子。当这些PRR识别到PMMP时，它们被激活，从而触发细胞内相关信号通路，这可能导致炎症细胞因子的上调或抑制，即机体免疫反应的促进或减弱。MTB和宿主细胞的相互作用十分复杂，涉及到多种天然免疫细胞、PRR、PAMP及不同的细胞内信号通路。能够识别MTB DNA的PRR如下：

1.TLR：TLR在MTB感染防控过程中至关重要。TLR现在被认为是免疫细胞识别MTB的关键识别受体。迄今为止，研究人员已经在哺乳动物中鉴定出13个TLR[人类为10个TLR (TLR1~TLR10)；小鼠为12个TLR (TLR1~TLR9, TLR11~TLR13)]。并且，所有的TLR均是由胞外细胞结构域 (由一系列进化保守的富含亮氨酸的重复序列组成)、单通道跨膜结构域和细胞质Toll/白细胞介素(IL)-1受体 (Toll/interleukin-1 receptor, TIR) 结构域组成的保守结构。TIR结构域介导TLR和衔接蛋白之间的相互作用[如骨髓分化初级反应蛋白88 (myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)、含有TIR结构域的衔接蛋白 (TIRAP、TRIF和TRAM)]。MyD88在激活MTB的先天免疫反应中起核心作用，与野生型小鼠相比，MyD88敲除小鼠更容易感染MTB；包含衔接诱导IFN-β的TIR结构域衔接蛋白 (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β, TRIF) 细胞内信号通路是除MyD88外的第二条信号通路。

TLR2和TLR4是针对MTB研究最多的TLR。TLR2的配体众多，MTB脂蛋白、脂质聚糖与糖脂化分子均可被TLR2识别进行信号传导，诱导巨噬细胞的成熟和活化，并触发不同的下游信号级联反应。TLR2与TLR1或TLR6形成异二聚体后，也可识别多种MTB PAMP，包括三酰基和二酰基脂肽和肽聚糖，从而激活下游天然免疫反应。具有TLR2遗传多态性的人对结核病的易感性大，表明TLR2在对MTB的免疫反应中的重要性。TLR4是TLR的独特成员，在细胞质和内体膜上均有表达，并可激活TRIF和MyD88两条信号通路。TLR4的经典配体是革兰阳性菌的LPS。除此以外，在MTB侵染的情况下，TLR4可以识别一些MTB大分子，包括热休克蛋白、甘露聚糖及糖脂蛋白等。LPS可以通过TLR4激活巨噬细胞，改善其杀菌活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的产生，促进抗感染免疫反应。MTB的消除依赖于TLR4-NOX2轴，LPS除了上调TLR4的表达外，还可以通过激活TLR4-NOX2通路产生ROS来增强巨噬细胞的杀菌活性。TLR4和TLR8在内体上的异源二聚化可通过TLR8配体 (例如微生物RNA) 参与对MTB的识别，从而诱导Th1细胞免疫反应。然而，TLR4在抗MTB的免疫应答中似乎也可发挥负面作用，例如：MTB磷脂酰肌醇甘露糖苷分别下调MyD88和TRIF依赖通路中的TLR4促炎细胞因子和共刺激分子的表达。

在TLR中TLR9是能够识别DNA的典型代表。在人源细胞中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10存在于宿主细胞膜上，主要靶向微生物表面成分，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9存在于内体性溶酶体膜并且靶向核酸。TLR9位于浆细胞样树突状细胞和单核细胞/巨噬细胞的内膜，该受体可识别细菌和病毒DNA中的未甲基化核酸，特别是胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤 (CpG) 序列。此外，研究发现，TLR9的变化会影响MTB表达水平和功能，从而导致疾病易感性增加。例如：TLR9基因上内膜多态性rs352139位点的等位基因A可能增加墨西哥美洲印第安人结核病的患病风险。在北印度人群中同样发现，与健康对照组相比，TLR9基因中G2848A单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 的A等位基因在结核病患者中的频率略高。除等位基因“A”外还发现等位基因“C”，TLR9启动子的SNP rs187084 (T-1486C) 位点处的次要“C”等位基因是可能决定个体对结核病易感程度的因素之一。

2.环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 (cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)：cGAS已进化出多种检测策略，可灵敏地识别各种病原体DNA，例如：分布范围广、利用感染过程的生成物刺激增强其敏感性。作为关键的细胞质DNA识别受体，cGAS可参与许多先天性免疫反应，特别是在抗病毒、抗感染和免疫佐剂方面。cGAS作为一种DNA识别受体可以识别MTB DNA激活宿主的天然免疫反应，例如：cGAS对慢性感染MTB的小鼠具有保护作用，cGAS-/-小鼠对MTB敏感性增强，死亡率高。

3.ALR：除了被cGAS这一DNA识别受体识别外，MTB的DNA还可以被另一种重要的DNA识别受体AIM2识别。AIM2是ALR蛋白质家族的成员之一。其主要由N端Pyrin结构域和C端具有200个氨基酸重复序列的造血干扰素诱导核蛋白 (HIN200) 结构域组成。结构研究表明，HIN结构域由2个寡核苷酸/寡糖结合折叠结构域组成，这些折叠已被证明与DNA的两条链结合，所以AIM2炎症小体能够识别双链DNA，而不是单链DNA。与AIM2同属ALR的IFI204 (IFI16的小鼠同源物) 也被推定为细胞内DNA的识别受体。这些研究表明，宿主细胞可使用多个识别系统来感知MTB DNA的存在 (图1)。

注 PRR：模式识别受体；MTB:结核分枝杆菌；PAMP：病原相关分子模式；TLR：Toll样受体；CLR：C型凝集素受体；NLR：NOD样受体；ALR：黑色素瘤缺乏因子2样受体；cGAS：环鸟苷酸-腺苷酸合成酶；AIM2：黑色素瘤缺乏因子2；DHX36：RNA解旋酶DEAH盒家族成员

图1   各模式识别受体所识别结核分枝杆菌病原相关分子模式种类

三、PRR识别MTB DNA激活天然免疫的机制

1.TLR9识别MTB DNA：TLR9在对MTB的免疫反应中起重要作用，结核病患者似乎存在TLR9信号传导缺陷。TLR9可以识别MTB DNA，随后TLR9信号传导激活巨噬细胞促炎反应并诱导T细胞分化。

体外研究表明，MTB DNA是树突状细胞和巨噬细胞产生依赖性促炎细胞因子的有效刺激物。这些细胞对活分枝杆菌的体外反应也部分依赖于TLR9。体内研究表明，缺乏TLR9的小鼠比野生型小鼠更容易被MTB感染。TLR9和TLR2双重缺乏的小鼠表现出IL-12p40和IFN-γ的产生缺陷，对MTB的易感性增强，单独缺乏TLR9的小鼠对低剂量MTB气溶胶攻击表现出一定程度的抵抗力，这表明TLR2可以弥补TLR9的缺陷，为TLR在宿主抵抗感染中协作提供了重要例子。虽然宿主通常可能受益于多个TLR信号的整合，以产生对TLR刺激模式独特的反应，但某些刺激模式可能会产生不利于宿主对某些病原体的反应的信号传导结果。未甲基化的CpG DNA通过TLR9发出信号以诱导Ⅰ型IFN (IFN-α/β)，从而增强主要组织相容性复合体Ⅰ抗原交叉加工，但通过TLR2发出信号的脂蛋白不诱导IFN-α/β，并且可抑制TLR9对第一波IFN-α和IFN-β mRNA的诱导，而对第二波IFN-I mRNA的诱导没有抑制。当TLR2和TLR9同时存在并被激活时，病原体可能利用TLR2对TLR9诱导IFN-I的抑制机制，逃避宿主的防御或者保护宿主免受IFN-I的有害影响。

2.cGAS识别MTB DNA：在MTB感染巨噬细胞期间，MTB基因组DNA激活细胞质内的DNA识别受体cGAS。cGAS识别细胞质中的MTB DNA，刺激第二信使2'3'-cGAMP的合成。第二信使2'3'-cGAMP激活干扰素基因刺激因子 (stimulator of interferon genes, STING) 的下游适配器分子，促进STING从内质网到核周微粒体区室的易位。在STING活化后，下游分子TANK结合激酶1 (TANK binding kinase 1, TBK1) 和干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3) 被激活，最终导致Ⅰ型IFN的释放。另外，在感知细胞质DNA时，cGAS/STING/TBK1似乎还可激活细胞内在抗菌防御，促进MTB的自噬。cGAS对于激活细胞内信号级联通路cGAS/STING，产生IFN以应对MTB的感染至关重要，但在MTB感染期间，宿主细胞中的MTB DNA丰度和cGAMP水平随时间下降，cGAS可能不会在感染后期促进IFN-β的产生，而RIG-Ⅰ/MAVS依赖性RNA传感途径在感染后的后期参与，是在宿主细胞中启动Ⅰ型IFN稳健产生的第二个重要因素，即cGAS是初始IFN-β生产所必需的。

3.ALR识别MTB DNA：体内研究表明，AIM2缺陷小鼠极易受到MTB的气管内感染，这是因为MTB感染宿主细胞后，AIM2缺陷的巨噬细胞炎症小体IL-1β和IL-18的激活受损，细胞更易受到细菌增殖和细胞死亡的影响，即来自MTB的基因组DNA在感染后存在于细胞质中，并以AIM2依赖的方式诱导了炎症小体的激活和天然免疫的产生。随后的研究发现，AIM2不仅介导炎症小体依赖性细胞因子IL-1家族的加工这一信号通路，也可通过MTB ESX-1分泌系统抑制IFN-β的产生。AIM2-IL-1β信号通路通过阻止STING和TBK1之间的关联来负向调节STING-IFN信号通路,保护宿主免受MTB感染。并且与IFN反应相关的先天免疫基因PYHIN1-IFI16-AIM2 rs1633256和rs1101998的多态性与MTB感染的易感性增加有关 (即系统结核菌素皮肤试验阳性)。

IFI204胞质DNA识别受体也可识别MTB胞外DNA，并利用ESX-1系统、STING/TBK1/IRF3途径激活胞质监测途径，从而在MTB发病机制中起着关键作用，即可能促进了结核病中Ⅰ型IFN的高表达。

4.其他识别受体识别MTB DNA：除上述模式识别受体外，胞质内的某些DNA识别受体也能够通过识别胞浆内MTB的DNA来引发免疫反应。先前的一项研究认为DHX36以Myd88依赖性方式感知低甲基化的CpG DNA。随后的研究表明DHX36可能参与结核病的诊断和治疗。

来自不同MTB谱系的DNA会导致人类单核细胞/巨噬细胞炎症反应的差异，维生素D在增加对某些MTB谱系DNA的低IRF反应方面很重要，为MTB未来的治疗提供了思路。尽管目前已发现少数MTB DNA识别受体，但相信未来会发现越来越多的核酸识别受体，并了解它们激活宿主先天免疫的机制。

四、MTB DNA的应用前景

迄今为止，疫苗一直是世界上最重要的医疗干预措施之一。DNA疫苗是疫苗发展的新希望，与传统疫苗相比，其制备简单，并且能诱导强烈的体液免疫和细胞免疫反应，使其在抗细胞内感染中独具优势。MTB DNA疫苗是被设计用来预防感染的，但也有明显的治疗作用。研究发现，IL-2和热休克蛋白65 (heat shock protein 65, HSP65) 融合基因的DNA疫苗表达通过改善Th1型免疫反应增强了HSP65-DNA疫苗对小鼠结核病的免疫原性、保护性和治疗效果。随后的研究证实，DNA疫苗的组合或DNA疫苗与抗生素药物的组合，为耐多药结核病的治疗提供了一种新的策略。当HSP65疫苗与一线抗结核药物 (异烟肼或利福平) 联合给药时，可观察到协同治疗效果；并且，HSP65疫苗的皮内免疫对结核病的治疗效果比肌肉内或皮下免疫更强；多种疫苗 (HSP65和颗粒溶素疫苗、Ksp37疫苗和颗粒溶素疫苗) 的组合也显示出协同治疗效果。尽管近年来DNA疫苗取得了进展，与旧疫苗比有许多优点，但它们也存在缺点和局限性，例如：非蛋白质抗原无效、存在诱导产生DNA抗体及对抗原耐受的可能性等。其中，MTB DNA疫苗最大的不足是其安全性问题，DNA疫苗必须在人体细胞内才可以编码蛋白，就可能存在MTB DNA被整合入人体DNA的风险，这也是目前DNA疫苗很少被使用的原因。因此，需要进一步的研究来解决这些限制，获得最有效的疫苗。而嵌合DNA疫苗则是未来开发DNA疫苗的最新趋势。MTB DNA除在开发DNA疫苗用于结核病的预防与治疗外，在诊断方面也有一定的应用价值。目前，大多数结核病诊断检测需要痰液和灌洗液样本，痰液显微镜检查是最广泛使用的检测方法，但此法在难以提供痰液的人群 (例如儿童、HIV并发结核病患者、肺外结核和无痰/少痰者) 中的适用性有限，导致结核病的快速早期诊断非常困难。研究表明，DNA是一种用于检测和监测MTB感染的免疫相关微生物标志物，可用于结核病的快速早期诊断。核酸扩增试验为微生物鉴定提供了准确快速的方法，无需繁琐的生化试验，对于检测生长缓慢和挑剔的微生物特别有用。MTB DNA qPCR检测技术以非痰液样本为检测基础，数小时内以高诊断性能进行检测，从而为结核病诊断提供新方法，在结核病领域中具有广阔的应用前景。但该技术目前还没有标准化的共识或指南，在结核病研究领域中尚处于起步阶段，作为一种新型的分子标志物检测，其仍存在一些亟待解决的问题，如提取早期患者的DNA难度较高、稳定性较差、需消耗大量的精力和物力等。

五、总结和展望

MTB感染期间宿主发生的组织破坏和相关疾病的发病机制不仅由病原体单独介导，也包含宿主的过度炎症反应。针对MTB DNA的识别是一个复杂的过程，其中一些受体可以识别病原体的特定PAMP。PRR对PAMP的识别可以激活不同的细胞信号级联通路，以便诱导宿主防御机制的有效激活。MTB与宿主间相互博弈的动态过程及分子机制为抗结核治疗和药物研发提供了新思路和特异性靶点。笔者通过对MTB DNA的来源及MTB DNA介导PRR的介绍，分析了PRR与MTB DNA之间的关联，从免疫学的角度审视MTB DNA给机体造成的损伤机制，以期为DNA疫苗和药物的研发更新思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献 王文敬：实施研究、起草文章；孙宏：对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；孙照刚：对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、指导

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号