猪小肠黏膜下层（SIS）的生化和生物力学特征

1 引言

慢性创伤影响着数百万美国人，每年给美国造成的损失超过500亿美元。这些伤口会显著降低生活质量，导致疼痛、行动不便、干扰日常活动，在某些情况下还会导致截肢。尽管标准护理对一些患者有效，但40-60%的慢性溃疡在治疗3个月或更长时间后仍未愈合。

慢性伤口的分子环境表现出许多阻碍愈合的变化。高水平的炎性细胞因子与慢性炎症有关，高水平的基质金属蛋白酶（MMPs）降解细胞外基质（ECM）。ECM的降解会干扰细胞与ECM的动态和相互作用，而这些相互作用在伤口愈合的每一步都至关重要。

猪小肠黏膜下层（SIS）是一种无细胞的生物ECM（见图1），已被应用于慢性伤口，试图解决ECM缺陷并刺激细胞与ECM的相互作用，这是愈合所必需的。在随机对照试验中，与单独的标准护理相比，SIS可以显著提高伤口愈合的百分比和愈合率。这些临床发现得到了大量研究SIS生化和生物力学特征的临床前研究的支持。在这篇综述中，我们总结了与SIS基本特性相关的临床前研究结果，比较了数据可用的单层和三层SIS结构。

图1 SIS材料润湿后拉伸状态

2 SIS的结构和生化特性

如表1所示，SIS的结构特性和生化成分已经过充分研究。猪SIS的厚度范围为0.05至0.22 mm，具有可变的多孔微观结构，孔隙范围为20至30μm，能够进行维持细胞增殖和活力所需的氧气扩散。Androjna等人确定SIS的氧扩散系数为7×10^-6-2×10^-5 cm²/s。同样的分析表明，工程ECM、人类真皮（Alloderm®）和犬阔筋膜的氧扩散系数分别为1.9-3.1 x 10^-5 cm2/s和1.6-4 x 10^-5 cm/s。

与真皮细胞外基质一样，SIS主要由I型胶原纤维组成（见图2中的纤维结构），但也含有少量弹性蛋白和III、IV和VI型胶原。已在SIS中鉴定出介导细胞粘附到细胞外基质的多结构域糖蛋白，如纤连蛋白和层粘连蛋白。此外，SIS含有糖胺聚糖和蛋白聚糖，它们提供细胞附着和生长因子结合位点，螯合基质降解酶，并增强细胞对损伤组织的渗透。据报道，SIS还可释放生长因子，包括成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子（VEGF）。

表1 猪SIS的结构特性和生化组成

图2 SIS材料的微观结构（光学显微镜，10X，干态）

3 SIS对细胞生长和分化影响的机制

在体内，细胞和ECM表现出连续的双向相互作用，称为动态互惠。这些相互作用发生在细胞微环境的改变和稳态条件下，以及组织修复、血管生成、胚胎发生和恶性转化过程中。例如，微环境的变化（例如，由于组织损伤）可能导致细胞基因表达的变化，从而改变细胞外基质，导致基因表达和细胞骨架特性的进一步变化。

细胞主要通过整合素结合与内源性ECM相互作用。细胞与SIS相互作用的机制可能也涉及整合素结合。Hodde等人评估了纤连蛋白中的肽序列，该肽序列可能对细胞粘附SIS很重要。对人微血管内皮细胞的研究结果表明，RCG和REDV在SIS的附着中发挥作用，这表明整合素与SIS中这些序列的结合可能介导细胞附着。Badylak等人发现，人类微血管内皮细胞与SIS的粘附取决于其组成和结构。此外，Hurst等人报告称，β1、β4和α6整合素的中和作用改变了膀胱癌症细胞对SIS的粘附，表明这些整合素亚基在细胞粘附中的重要性。

Hodde等人进行了几项研究，以研究SIS中生长因子的释放及其对体外细胞分化和血管生成的影响。针对FGF-2的中和抗体抑制了SIS诱导的PC12细胞的分化，增加了FGF-2可能有助于体内对SIS的生物反应的可能性。类似地，在基于纤维蛋白的血管生成测定中，针对VEGF的中和抗体阻断了SIS诱导人类微血管内皮细胞形成管的能力。

4 基质金属蛋白酶与SIS相互作用

各种研究报告称，慢性伤口液中存在高MMP水平和高活性。在慢性伤口中发现的过量MMPs被认为是导致伤口慢性化的关键因素；因此，降低慢性伤口中MMPs的升高水平可以促进愈合。

Trengov及其同事提供了支持这一假设的临床证据，他们报告说，随着慢性静脉溃疡开始愈合，蛋白酶水平下降，Ladwig及其同事也提供了支持，他们报告称，慢性压疮的最佳愈合与MMP-9/金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的比值较低有关。因此，MMP水平的控制可以改善慢性伤口中发现的不良愈合条件。

Shi等人进行了几项研究，以研究SIS和MMPs之间的相互作用。MMP-1、MMP-2和MMP-9表现出不同的结合亲和力，表现为与SIS孵育24小时后溶液中的活性损失分别为53.8%、85.9%和36.9%。进行了一项人类角质形成细胞迁移研究，以评估MMPs和SIS处理的MMP溶液对细胞迁移的影响。这些数据表明MMPs在体外抑制角质形成细胞的迁移，并且通过将MMP溶液与SIS预孵育可以显著减少这种抑制。使用糖尿病小鼠伤口愈合模型在体内观察到类似的活性。在受伤后第3天和第7天采集活检样本，通过明胶酶谱分析MMP水平。发现MMP活性在第3天被SIS处理最大程度地减弱。在第7天，衰减变得不那么显著，表明SIS的MMP结合能力已经饱和。总之，这些模型的结果表明，SIS在施用后立即降低MMP活性，并降低MMP-1、MMP-2和MMP-9对角质形成细胞迁移的抑制作用。

5不同厚度SIS的酶降解研究

为了提高SIS在不同临床情况下的实用性，SIS结构被设计成具有不同的厚度。这些结构由1、2、3或4层SIS矩阵组成（见图3）。设计了一项体外研究，以确定四种SIS厚度在含有胶原酶、中性蛋白酶和其他设计用于模拟伤口环境的蛋白酶的蛋白水解溶液中的相对降解性。在37°C下培养2小时后，使用SIS的残留物干重计算降解水平。

结果表明，产品的降解与层数成反比。在测试条件下，1层基质被消化了约82%。在相同条件下测试时，双层基质的重量损失了75%，略小于单层基质。发现3层（49%）和4层（47%）基质的降解显著减少，这表明层数越高，材料的耐久性就越高，酶降解的敏感性就越低。然而，在3层和4层材料之间，厚度效应变得不那么显著，这表明在一定的厚度水平下，降解将饱和。

图3 显示一层、二层、三层和四层SIS结构厚度比较的截面图（干态）

6 SIS在猪伤口和糖尿病小鼠伤口中的持久性

随着时间的推移，SIS材料会融入伤口床中，一些伤口需要反复应用才能闭合。根据在蛋白水解溶液中获得的结果，多层SIS在伤口床中的持续时间预计比单层SIS更长。

在猪和小鼠伤口试点研究中评估了不同厚度SIS材料在体内的掺入。在猪模型中，将1层SIS和3层SIS应用于清创术后的烧伤伤口。施用四天后，1层SIS被明显地并入，同时保留了实质上未合并的3层SIS基质。在研究过程中，所有伤口都形成了柔软的焦痂表面层，这使得在研究后期无法对掺入进行准确的视觉评估。

在SIS应用后10天和17天，从每次治疗的两个伤口上采集活检样本。组织学表明，到第10天，1层SIS已经结合在伤口表面，而3层SIS样品仍然表现出不同的层，尚未结合到伤口床中。在第17天，所有四个SIS处理的样品都显示出一定程度的再上皮化，而两个对照样品中的一个没有显示出再上皮化。

在糖尿病小鼠模型中，在受伤当天和3天后将1层SIS和3层SIS应用于全层伤口。随着时间的推移，对伤口的检查表明，1层SIS在很大程度上或完全结合到治疗的伤口中，而3层SIS具有显著的未结合层。这些研究表明，增加SIS基质厚度的一个好处可能是需要减少频繁应用。

7 不同基体层SIS的力学特性比较

比较了1层、2层、3层和4层SIS结构的力学特性。一层的厚度约为50μm。极限抗拉强度、弹性模量、伸长率和缝合线保持强度在潮湿和干燥条件下都进行了测定。当在干燥条件下测试时，峰值强度随着层数的增加而增加（表1）。然而，随着层数的增加，材料的伸长程度就越高。SIS材料的弹性模量差异不大，表明它们都具有相似的材料应力-应变特性。

与干态试验相比，所有材料的湿峰应力都较低，1层SIS样品明显低于多层样品。然而，在多层样品之间没有发现统计学上的显著差异。在潮湿条件下，伸长率与层数和峰值应力呈反比。单层SIS伸长最多（~130%），而所有多层SIS伸长30-40%。

潮湿条件下的弹性模量也与干燥条件下的结果不同。对于每个增加的层，测量到更高的模量。对于缝线保持力试验，潮湿条件提供了更高的保持力。湿样品和干样品都显示出相同的趋势，即材料中的更多层导致更大的缝合线保持力（表1）。

8 结论

SIS是一种经过充分研究的生物材料，可显著改善慢性伤口的愈合。作为一种天然存在的ECM，SIS支持多种细胞类型的粘附、增殖、迁移和分化。SIS的生物活性包括释放生长因子，最大限度地降低MMPs的破坏活性，以及诱导血管生成以支持新血管的生长。SIS是可生物降解的，可以很好地结合到组织中。最近，研究表明，与单层SIS相比，新型多层SIS具有更强的力学特性，并且在伤口处降解更慢。因此，多层SIS结合了SIS已知的有益特性和更高的耐用性，以满足不同组织和伤口的修复需要。

参考文献：Shi L, Ronfard V. Biochemical and biomechanical characterization of porcine small intestinal submucosa (SIS): a mini review. Int J Burns Trauma. 2013 Nov 1;3(4):173-9. PMID: 24273692; PMCID: PMC3828736.