快报 | 核酸质谱在结核分枝杆菌耐药性检测中的价值

基金支持：西安市创新能力强基计划-医学研究项目（21YXYJ0001）

作者：杨翰，李爱芳，党丽云，康涛，任斐，马进宝，周永，杨元利，雷静，张涛

第一作者及单位：杨翰，西安市胸科医院转化医学中心；李爱芳，西安市胸科医院检验科

通信作者及单位：雷静，西安市胸科医院检验科

A rapid, accurate, and low-cost method for detecting Mycobacterium tuberculosis and its drug-resistant genes in pulmonary tuberculosis: Applications of MassARRAY DNA mass spectrometry.

Yang H, Li A, Dang L, Kang T, Ren F, Ma J, Zhou Y, Yang Y, Lei J, Zhang T.

Front Microbiol， 2023，14:1093745.

doi: 10.3389/fmicb.2023.1093745.

PMID: 36910195.

研究背景

目前，耐药结核病的实验室诊断主要依靠传统的分枝杆菌培养（DST），并依赖药物敏感性试验（简称“药敏试验”）和核酸扩增试验。传统的DST覆盖的药物更全面，可获得准确的药敏信息。但结核分枝杆菌（MTB）生长周期长，需1～2个月才能报告。在此期间，对耐药结核病患者无效的药物治疗将造成更大的身体、心理和经济压力。因此，利用分子诊断技术快速诊断耐药结核病已成为近年来的主要研究方向。耐药是由编码药物靶点的染色体基因中的单核苷酸多态性 (SNP)、多核苷酸多态性、插入和缺失 (indel) 以及重排介导的。与耐药相关的基因型-表型关系因遗传改变类型而异。无义突变和遗传补偿反应与细菌耐药性的相关性较低。Xpert系统是临床上常用的分子检测技术，2 h内可获得MTB和利福平rpoB耐药结果，但不能获得基因位点突变类型。Bruker-Hain和基因芯片技术是基于聚合酶链式反应的探针杂交技术，可以获得多种抗结核药物的基因位点突变结果。高分辨率熔解曲线分析 (high-resolution melting, HRM)是一种简单、快速且经济有效的方法，可在封闭管中进行，该方法根据测试DNA和参考DNA之间的熔解温度差异检测序列变异。它可以检测目标基因是否发生突变，但不能获得突变位点的具体信息。Sanger测序技术是基因检测的金标准，但通量低。而具有高通量特征的下一代测序 (next-generation sequencing, NGS) 技术不是一种“用户友好”的技术，需要昂贵的仪器、生物信息学和训练有素的人员，大多数临床实验室无法获得，特别是在结核病高发的国家。因此，迫切需要一种能够获得准确突变位点的高通量、低成本检测技术来诊断耐药结核病。DNA飞行时间质谱（MassARRAY系统）是一种 通量灵活的超灵敏突变检测系统，大多数MTB耐药基因位点的检测可在1～2个反应体系内获得，其准确度在原理上与Sanger法相近。本研究旨在通过分析检测限 (LOD) 及临床应用价值，评价MassARRAY系统在耐药结核病诊断中的应用价值。

研究方法

一、标本来源及研究流程

从西安市胸科医院采集222例确诊结核病患者的临床标本，包括52份支气管肺泡灌洗液 (BALF)、42份痰液（sputum）、128份MTB临床分离株。MTB参比株H37Rv购自中国疾病预防控制中心，CMCC95102/CMCC95103购自国家医学培养物收藏中心。野生型和突变型质粒混合物由生工生物技术（上海）有限公司合成。研究流程如图1所示，通过初步检测性能分析和临床应用价值，评估MassARRAY系统在耐药结核病诊断中的应用价值。

图1  实验设计

二、检测性能分析

采用MassARRAY的LOD进行初步检测性能分析，将参比菌株稀释为10²、10³、10⁴、10⁵ CFU/ml。采用临床常用的3种核酸提取方法（磁珠法、柱提取法和玻璃珠法）提取参比菌株DNA，用于检测MassARRAY在MTB鉴定和耐药基因检测中的LOD。MTB参考菌株H37Rv、CMCC95102和CMCC95103重复试验。MassARRAY检测到2个鉴定位点和25个耐药基因位点（表1），可检测到的最低浓度为LOD。

表1  MassARRAY和HRM基因检测位点的描述

三、临床应用价值

采用MassARRAY、实时定量聚合酶链式反应（qPCR）和MGIT 960液体培养（简称“培养”）检测BALF和痰标本中的MTB。以培养为参照标准，分析MassARRAY和qPCR检测结核病的效能。采用MassARRAY、HRM和Sanger测序技术检测MTB临床分离株的耐药基因突变。以Sanger测序技术为参照标准，分析MassARRAY和HRM对MTB各耐药位点的检测效能。将 MassARRAY方法与DST的检测结果进行比较，分析了基因型-表型关系。最后，使用 H37Rv菌株与耐多药临床分离株的混合物，以及不同耐药基因野生型质粒与突变体质粒的混合物，用于鉴定 MassARRAY区分异质性耐药的检测能力。

研究结果

一、临床参与者的基线特征

本研究所有临床分离株均来自2021年6—12月在西安市胸科医院确诊的结核病患者。其中，94份临床标本中痰液标本42份，BALF 52份；128株MTB临床分离株中耐多药 (MDR) 菌株30株，耐利福平 (R-R) 菌株 21株，敏感株77株。参与者的基线特征见表2。

表2 临床分离样本中结核病患者的基线特征

二、MassARRAY的LOD

采用3种核酸提取方法提取的DNA进行MassARRAY的LOD检测。结果显示，磁珠法和玻璃珠法对2个MTB鉴定基因的LOD均为10² CFU/ml，柱提取法为10⁴ CFU/ml。在25个耐药基因位点检测中，磁珠法和玻璃珠法的LOD均为10⁴ CFU/ml，柱提取法为10⁵ CFU/ml。当细菌浓度低于10⁴ CFU/ml时，玻璃珠法测得异烟肼、利福平耐药基因rpoB、katG和inhA的LOD达到10² CFU/ml。说明MassARRAY采用玻璃珠法提取核酸，LOD更低。具体见图2。

注 A=磁珠法，B=柱提取法，C=玻璃珠法；1、2、3指H37Rv、CMCC95102和CMCC95103。E2～E5指10²～10⁵ CFU/ml。每份样品都经过MassArray测试3次，并选择最低检测值进行统计分析。0～4指测试结果的质量，0 = No-Alleles, 1 = Low Probability, 2 = Aggressive, 3 = Moderate, 4 = Conservative，值为1时，确定触发阳性反应的最低细菌负荷

图2  MassArray LOD 热图

三、MassARRAY在MTB鉴定中的诊断效能

如表3所示，培养、MassARRAY和qPCR检测的阳性率分别为34.0%（32/94）、51.1%（48/94）和40.4%（38/94）。在94例确诊结核病患者中，培养阳性和阴性患者的MassARRAY检测阳性率分别为96.9%（31/32）和27.4%（17/62），均高于qPCR检测的87.5%（28/32）和16.1%（10/62）。以培养物为参照标准，MassARRAY检测的总体敏感度为96.9%，高于qPCR的87.5%；各样本类型的敏感度也高于qPCR检测。因此，与传统qPCR技术相比，MassARRAY具有更高的诊断效能。

表3  临床样本中结核病鉴定的检测效能

四、MassARRAY对MTB耐药基因的诊断效能

以Sanger测序为金标准，MassARRAY对所有耐药基因突变的检测敏感度和特异度均为100.0%，准确率和一致性高，与测序结果一致。HRM检测耐药突变的敏感度和特异度分别为89.3%和96.9%，均低于MassARRAY方法。HRM在gyrA_94基因中与其他两种方法的差异有统计学意义（P=0.006），而其他基因中测序与MassARRAY的检测结果一致，差异无统计学意义（P > 0.05）。将所有的12个基因作为整体进行比较，两种方法的差异有统计学意义（P=0.001）（表4）。

表4  MassARRAY对基因突变的检测效能

五、MassARRAY检测基因型与DST表型之间的关系

部分药物的基因突变与表型高度相关，如katG_315、rpoB_531、rpsL_43、rpsL_88、rrs_513，如表5所示。在embB、gyrA_94和rpoB_526中，不同的单碱基突变类型与表型的相关性不同。例如，embB_306 ATG >GTG（G）突变与表型结果一致（准确率：100.0%）；ATG > ATA（A）和 ATG > ATC（C）的相关性较差（准确率：25.0% 和50.0%）；rpoB_526 CAC>AAC（A）也出现了相关性差的现象（准确率：33.3%）；rpoB_526 CAC > CTC（T）、GAC（G）、TAC（T）突变与表型结果一致（准确率：100.0%）。

表5  MassARRAY检测基因型与DST表型之间的关系

六、MassARRAY对异质性耐药的检测能力

耐药基因突变质粒和野生型质粒按不同比例混合，MassARRAY检测结果表明：当突变比例至少为5%～25%时，可以同时检测到突变型和野生型质粒（图3A）。H37Rv和耐多药MTB分离株按不同比例混合，MassARRAY检测结果表明：当混合物浓度为10⁵ CFU/ml（分别达到10⁴ CFU/ml）时，能够鉴定异质性耐药；当浓度低于10⁵ CFU/ml时，部分耐药基因的检测效能下降（图3B）。此外，变异株的质量强度值与耐多药MTB浓度呈正相关，并且质量强度信号不受耐多药分离株与H37Rv菌株比例的干扰（图3C）。

图3 异质性耐药的检测能力。A：质粒异质性耐药检测能力百分比堆叠图。质粒浓度为10⁷拷贝/μl，以不同比例混合，最终体积为 100 μl。B：细菌异质性耐药检测能力热图。临床分离的耐多药分离株与H37Rv菌株按20%～80%的比例混合，浓度为E3～E6（10³～10⁶ CFU/ml），最终体积为1 ml。例如，E3-20是指混合物的浓度为10³ CFU/ml（临床分离的耐多药分离株的20%和H37Rv的80%）。C：不同比例的MDR-MTB的质量强度值折线图。质量强度折线图中细菌混合物的浓度为10⁵ CFU/ml

意义及展望

MassARRAY系统是一种能够准确获取大量耐药基因突变信息并识别异质性耐药的分子检测技术。同时具有LOD低、操作流程简单、高通量、检测成本低等特点，在临床耐药结核病诊断中具有良好的应用前景，尤其适用于结核病专科医院。

本文来源于中国防痨杂志期刊社公众号