EMBO Mol Med. (Q1，12.137)|YAP/TAZ和ATF4抵抗铁死亡驱动肝细胞癌对索拉非尼的耐药性

文章信息

发表期刊：EMBO Molecular Medicine

影响因子：12.137

发表时间：2021年

合作单位：University of Basel

样品类型：HEK‐293T, SNU398, HT1080，Huh7, HLE, Hep3B cells，overexpressing SLC7A11，233 HCCs, 119 cirrhotic tissues, and 19 normal liver samples，2‐ to 3 month‐old male immunodeficient NOD/SCID; common γ receptor^−/− (NSG) mice

运用技术：细胞活力测定，克隆形成，双荧光素酶报告基因，谷胱甘肽测定，胱氨酸摄取测定，细胞脂质测定，ROS测定，IP，泛素化，ChIP，RT-PCR，免疫组化，免疫荧光，肿瘤移植，RNA测序

研究背景

肝癌是癌症患者死亡的第二大原因。肝细胞癌（HCC）约占所有原发性肝癌病例的90%，阐明HCC潜在的规避性耐药机制是一个尚未得到满足的医学需求。

铁死亡是一种新兴的细胞死亡类型，由金属铁和活性氧物种（ROS）诱导，并由脂质过氧化驱动。因此，半胱氨酸剥夺和GPX4抑制可以潜在地诱导铁死亡。小型药理抑制剂如GPX4抑制剂RSL3，以及作为xCT介导的输入功能的直接抑制剂的erastin和索拉非尼，广泛用于诱导铁死亡。

YAP/TAZ是Hippo信号的转录效应器，参与多种生理病理过程，包括肿瘤发生和组织再生。此前的研究表明，Hippo YAP/TAZ通路是上皮性肿瘤中铁死亡的关键驱动因素。

重要结果

1. YAP/TAZ是索拉非尼耐药性的关键驱动因素

作者在索拉非尼耐药HCC细胞中进行了全基因组shRNA介导的合成致死性筛查，将合成致死性筛选的结果与在建立抗药性过程中差异调节的基因列表叠加，从而揭示出8个显著的命中，其中Hippo通路传感器WWTR1也被称为TAZ。实验发现与敏感细胞相比，YAP和TAZ在索拉非尼耐药细胞中高表达（图1C）。shRNA介导的YAP和TAZ表达的消融表明，二者是维持索拉非尼获得性耐药性所必需的。

以上结果表明YAP和TAZ是HCC细胞获得性索拉非尼耐药性的关键驱动因素。

2. YAP/TAZ通过对抗索拉非尼诱导的铁死亡而促进抵抗固有索拉非尼耐药HLE细胞系与索拉非尼敏感细胞系相比，表达了大量YAP和TAZ蛋白。参与调节脂质过氧化的基因显著富集（图1E）。此外，siRNA介导的HLE细胞中YAP和TAZ的丢失导致HLE细胞中ROS的基础水平上调（图1F）。即使在没有任何治疗的情况下，YAP和TAZ功能的丧失也会导致脂质过氧化增加（图1G）。在索拉非尼存在的情况下，Fer-1完全恢复了YAP/TAZ缺陷细胞的生存能力（图1H）。Erastin处理HLE细胞诱导铁死亡，在shRNA介导的YAP和TAZ消融后进一步增强，并且用Fer-1治疗可以阻止细胞死亡，这表明细胞死亡是由铁死亡引起的。

以上结果表明YAP和TAZ作为铁死亡的一般抑制剂，从而促进索拉非尼耐药性。

3. YAP/TAZ转录上调SLC7A11

YAP/TAZ缺失的HLE细胞中表达下调的基因列表（抑制铁死亡的）和索拉非尼耐药细胞中表达上调的基因列表（抑制铁死亡的），确定了56个基因，其中SLC7A11编码已知调节铁死亡的胱氨酸谷氨酸转运体（图2A）。SLC7A11 mRNA在原发性肝癌、HCC肿瘤切片中高度上调。此外，SLC7A11的高表达与较差的临床结果显著相关。

YAP和TAZ的联合敲除导致SLC7A11在mRNA水平和蛋白质水平的显著下调（图2B和C）。分析依赖于YAP/TAZ活性的SLC7A11启动子荧光素酶报告子结构的转录活性发现SLC7A11启动子对YAP/TAZ的缺失或存在完全有反应（图2D）。此外，对SLC7A11启动子序列的分析确定了一个潜在的TEAD结合基序，位于转录起始位点上游约400个碱基（图2E）。用针对YAP或TAZ的特异性抗体进行染色质免疫沉淀，然后进行定量PCR（芯片qPCR），证明YAP或TAZ与SLC7A11基因启动子中含有TEAD基序的DNA片段结合（图2F）。YAP/TAZ的敲除导致胱氨酸摄取受损（图2G）。此外，SLC7A11的强制表达能够防止YAP/TAZ缺陷HLE细胞中索拉非尼诱导的死亡（图2H）。肝癌患者样本中观察到YAP和SLC7A11蛋白水平之间存在显著的正相关（图2I和J），表明YAP是肝癌发展过程中SLC7A11基因表达的关键调节因子之一。

以上结果表明，作为YAP/TAZ的直接转录靶点，SLC7A11在HCC中上调，并且是HCC侵袭性和临床结果的预后因素。重要的是，SLC7A11在YAP和TAZ下游发挥作用，在HCC中驱动索拉非尼耐药性。

4. ATF4调节SLC7A11对索拉非尼处理的反应

在索拉非尼耐药细胞系HLE细胞（图3A和B）中，SLC7A11表达的主要驱动因素应是ATF4，而不是NRF2。实验发现ATF4本身在索拉非尼作用下上调（图3A），从而消除索拉非尼的影响，并在索拉非尼Huh7 IR和Huh7 CR细胞中高表达。在荧光素酶报告分析中，索拉非尼诱导的ATF4活性增加了SLC7A11启动子活性，这表明ATF4直接调节SLC7A11基因表达以响应索拉非尼（图3C）。ATF4的缺失导致ROS水平增加以及脂质过氧化（图3D和E）。两种不同的siRNA序列导致ATF4缺失，集落形成试验和细胞活力试验中细胞活力降低，并被Fer-1完全阻断（图3F）。与邻近肝实质相比，ATF4在肿瘤组织中的表达上调（图3H）。组织阵列也显示，ATF4在HCC肿瘤中高表达（图3I）。最后，ATF4和SLC7A11蛋白水平的显著相关性表明，这两种蛋白在患者的肝癌中共同表达（图3J和K）。

上述结果表明，ATF4是SLC7A11表达的关键调节因子，因此可以预防索拉非尼诱导的肝癌铁死亡。

5. YAP/TAZ稳定并引导ATF4进入细胞核

YAP/TAZ缺乏导致索拉非尼诱导的ATF4在蛋白质水平的表达显著下调（图4A）。通过免疫荧光显微镜分析以及细胞分离和免疫印迹法进行亚细胞定位，发现YAP/TAZ的缺失导致HCC细胞中的核ATF4减少（图4B-D）。此外，高密度培养导致YAP/TAZ的预期失活，但也降低了HCC细胞中ATF4的表达（图4E）。YAP/TAZ通过限制ATF4多泛素化从而稳定ATF4，从而促进ATF4功能。通过共免疫沉淀分析蛋白质-蛋白质直接相互作用，发现ATF4确实与YAP和TAZ物理结合（图4F）。野生型TAZ，尤其是组成性活性TAZ增加了核ATF4，而缺乏NLS的组成性活性TAZ未能将ATF4转移到核中（图4G）。YAP是HCC中ATF4蛋白水平的关键调节因子（图4H和I）。

以上结果表明YAP/TAZ与ATF4相互作用，并与TEAD一起促进其核输入，以防止其在细胞质中泛素化和蛋白酶体降解。

6. YAP/TAZ和ATF4协同调节SLC7A11的表达

RNA测序发现262个基因受YAP/TAZ和ATF4共同调控，其中包括ATF4靶点，如CHAC1和SLC7A11（图5A）。定量RT-PCR进一步证实，这些基因由YAP/TAZ和ATF4共同调控（图5B）。芯片qPCR分析显示ATF4确实与包含ATF3和SLC7A11基因启动子AARE区域的DNA片段结合（图5C）。

qPCR分析显示，YAP/TAZ也能够与SLC7A11基因启动子中含有AARE基序的DNA片段结合（图5D和E）。使用第一轮抗ATF4芯片和第二轮抗YAP/TAZ芯片进行芯片再芯片分析（图5F）。在第二轮芯片中，YAP/TAZ显著富集了SLC7A11基因启动子中的AARE基序（图5G），表明YAP/TAZ通过与ATF4结合，与包含SLC7A11基因启动子中AARE基序的DNA片段结合。

结果表明，YAP/TAZ和ATF4共同调节肝癌细胞中SLC7A11的表达。

7. 靶向性铁死亡在体内克服HCC索拉非尼耐药性

建立表达针对荧光素酶的shRNA（SNU398 shLuc）作为对照，或表达针对YAP和TAZ的shRNA（SNU398 shY/T）的SNU398细胞（图6A）。然后将这些细胞植入NSG免疫受损小鼠的侧腹，用溶媒对照或索拉非尼处理小鼠，YAP/TAZ缺乏导致索拉非尼治疗后肿瘤生长率降低以及终点分析时肿瘤肿块变小（图6B-D）。SLC7A11的药理抑制剂SSA或BSO处理小鼠。发现索拉非尼与SSA和BSO联合治疗导致肿瘤生长延迟（图6E）。组化分析证实抑制剂处理的肿瘤中脂质过氧化增加，而通过Ki67染色确定肿瘤细胞增殖没有显著影响（图6F和G）。

以上结果表明，YAP/TAZ或ATF4的基因消融或其转录靶基因产物SLC7A11或谷胱甘肽合成途径的药理学阻断可以通过铁死亡促进细胞死亡，有效地使肝癌肿瘤对索拉非尼治疗敏感。

原文总结

转录因子YAP/TAZ通过抑制索拉非尼诱导的铁死亡，是肝细胞癌（HCC）索拉非尼耐药性的关键驱动因素。YAP/TAZ以TEAD依赖的方式诱导SLC7A11的表达，SLC7A11是维持细胞内谷胱甘肽稳态的关键转运体，从而使肝癌细胞克服索拉非尼诱导的铁死亡。同时，YAP /TAZ维持ATF4的蛋白质稳定性、核定位和转录活性，进而协同诱导SLC7A11表达。该研究揭示了YAP/TAZ在抑制肝细胞癌铁死亡从而建立索拉非尼耐药性中的关键作用，强调了基于YAP/TAZ的重组策略是克服肝细胞癌治疗耐药性的潜在途径。