人 NKT 细胞高效扩增试剂培养及注意事项

NKT 细胞(Natural killer T cell)是一个具有 NK 细胞特性的 T 细胞亚群。是先天免疫系统的重要 组成部分，同时又是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一，是一种细胞表面既有 T 细胞受体 TCR，又有NK 细胞受体的特殊T 细胞亚群。NKT 细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4, IFN- γ, GM-CSF, IL- 13 和其它细胞因子和趋化因子，参与自身免疫性疾病的发生、肿瘤免疫以及对病毒、细菌、真 菌和寄生虫病原体的免疫防护。NKT 细胞具有 T 细胞 MHC 限制性杀伤特点，同时活化后具有 NK 细胞样细胞毒活性，可溶解 NK 细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas 配体以及 IFN-γ 。本试剂盒适用于从外周血单个核细胞在体外高效获得大量纯度较高 NKT 细胞。

【操作步骤】

一 血浆的提取与保存

注意：

1) 禁止使用EDTA 抗凝的血样，因为 EDTA 会极大影响 NKT 细胞的激活与增殖；

2) 所取血样最好不超过 12 小时，因为血样的时间越长，所提取的 PBMC 中杂细胞越多，且 PBMC 的活性会降低；

1.将取到的外周血置于 50mL 离心管中，室温下 650g ，离心 15min ；                       2.取上层黄色血浆部分于新的 50mL 离心管中 (下层为血液细胞成分，用于后续单个核细胞的提

取)；

3.将血浆置于 56°C 水浴锅中灭活 30min；

4.血浆灭活完毕后，可见血浆呈现浑浊状，900g ，离心 10min；

5.取上清，于-20°C 冷冻 15min；

6.冷冻完毕后，再次 900g ，离心 10min ，取上清，于 4°C 保存待用。

二 单个核细胞的提取

1.取血浆提取步骤的下层红色细胞沉淀，加入生理盐水或 PBS 至原体积；

2.取 2 支 50mL 离心管，分别加入 15mL 淋巴细胞分离液，并将 1 步骤中的稀释血液分别缓缓 铺加到淋巴细胞分离液的上层；

注意：铺加血样时建议速度适中，尤其是刚开始时的铺加， 避免破坏淋巴细胞分离液与血样的

界面。

3.室温下，800g 离心 20min (无闸减速)；

4.离心后，离心管中样品由上到下分为 4 层：血浆层- 白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒 细胞的沉淀。分别小心吸取白膜层及其以下约一半的液体于新的离心管中，并加入生理盐水或

PBS 至 40mL 体积，混匀，300g 离心 10min；

5.弃上清，沉淀再次用 40mL 的生理盐水或 PBS 重悬，300g 离心 10min；

注意：对于血小板较多的样本可重复 5 步骤 1-2 次。

6.弃上清，沉淀少许 NKT-IV 培养基重悬，合并，取部分细胞悬液计数，备用。

三 单个核细胞接种与补液

1.第 0 天，配制 30mL NKT 细胞完全培养基：NKT-IV 培养基 27mL ，10%已热灭活的自体血浆  (3mL) ，NKT-I 1000IU/mL 将制备好的单个核细胞 (MNC) 按 2-2.5M cells/mL 的细胞密度接 种于已含有 30mL NKT 细胞完全培养基的T175 瓶中, 静置于二氧化碳培养箱 37°C，5% CO2 培 养箱中培养；

注意：

1) 每支 IL-2 使用 1mL NKT-IV 培养基溶解后，可存于 2-8°C 冰箱，存放时间不超过两周。建 议将 IL-2 溶解后分装于无菌试剂管后保存于-20°C 冰箱，使用时溶解即可，注意不要反复冻融， 且不可使用长期置于 2-8°C 的 IL-2 ，否则将严重影响本试剂盒的扩增效果；

2) NKT-IV 在使用前，需先将其室温平衡 30min 以上，切勿将培养基直接从冰箱中拿出使用， 否则可能导致细胞出现应激反应。

2.第 1 天 (1×24h)，培养瓶中补加 NKT- IV 培养液 70mL ，5%已热灭活后的自体血浆 (3.5mL)， 的 NKT- II 、的 NKT- III 以及 500IU/ml IL-2；

3.第 4 天 (4×24h)，补加 NKT-IV 培养基 95mL ，5%已热灭活的自体血浆 (5mL) 以及 IL-2 (IL-2 终浓度为 500IU/mL) ，转入细胞培养袋，此时培养袋含 200mL 培养基；

注意：

为使更多的细胞转入到培养袋中，可先将 T-75 瓶中的细胞吹打均匀，全部转入培养袋中，再用

部分新鲜配制的培养液润洗培养瓶，并再次转入培养袋中，最后补齐培养液即可；

4.第 6 天，往培养袋补加 NKT-IV 培养基 200mL，1%已热灭活的自体血浆 2mL 以及 IL-2 (IL-2 终浓度为 500IU/mL)，此时袋子含 400mL 培养液；

5.第 8 天，往培养袋补加 NKT-IV 培养基 400mL ，剩余的所有自体热灭活血浆以及 IL-2 (IL-2

终浓度为 500IU/mL)，然后分成两袋，此时每个袋子含 400mL 培养液；

6.第 10 天，分别往每个培养袋补加 NKT-IV 培养基 400mL 以及 IL-2(IL-2 终浓度为 500IU/mL)， 此时每个袋子含 600mL 培养液；

7.第 12 天，分别往每个培养袋补加 NKT-IV 培养基 200mL 以及 IL-2(IL-2 终浓度为 500IU/mL)， 此时每个袋子含 1000mL 培养液；

8.第 14 天，或 15 天，收获 NKT 细胞。

1. 使用本试剂盒时，可先将 NKT-I，NKT-II，NKT-III 试剂管低速离心(如 1000g/min 离心 1min 等) ，确保试剂足量；

2. 由于样本之间的差异性，在按上述说明操作时，可根据具体细胞生长状态，调整补液时间；

3. 在使用本试剂盒时， 由于样本之间的差异性，每个样本的细胞长速与诱导率存在差异。