快报 | 分枝杆菌抗原持续刺激通过损害造血功能导致淋巴细胞减少

作者：李菲，马岩林，李小平，张丹，韩江媛，谭大权，米友军，杨小娟，王娟，祝秉东

第一作者及单位：李菲，兰州大学基础医学院病原生物学研究所/甘肃省循证医学与临床转化重点实验室/兰州大学结核病研究中心

通信作者及单位：祝秉东，兰州大学基础医学院病原生物学研究所/兰州大学结核病研究中心/兰州大学动物医学与生物安全学院

Severe persistent mycobacteria antigen stimulation causes lymphopenia through impairing hematopoiesis

Li F, Ma Y, Li X, Zhang D, Han J, Tan D, Mi Y, Yang X, Wang J, Zhu B

Front Cell Infect Microbiol，2023，13: 1079774.

doi: 10.3389/fcimb.2023.1079774.

PMID: 36743311

研究背景

由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）血行播散引起的粟粒性结核病是一种严重的结核病，常伴发淋巴细胞减少，但其发生机制尚不清楚。目前对MTB感染期间发生淋巴细胞减少的研究主要集中在外周血T细胞的变化，包括抑制T细胞增殖和诱导淋巴细胞凋亡。然而，最近的研究发现，MTB感染或持续抗原刺激可能会损害造血功能。因此，研究分枝杆菌抗原持续刺激对骨髓造血功能的影响及IL-7的治疗效果，为重症结核病防治提供依据，对进一步精准诊断和治疗重症结核病具有重要的意义。

研究方法

1. 研究对象：采用回顾性研究方法，选取2015—2019年兰州市肺科医院收治入院的28 047例肺结核患者，分析其中104例粟粒性肺结核患者外周血血细胞数量的变化情况。

2. 建立BCG感染动物模型：应用大剂量BCG替代MTB感染小鼠来模拟临床粟粒性肺结核感染过程。首先，使用大剂量BCG（5×10⁷ CFU/ml）分别以尾静脉注射和滴鼻的方式感染小鼠，同时设立低剂量BCG（5×10⁵ CFU/ml）滴鼻感染组和PBS组作为对照，分别于感染后3周、5周和8周，使用动物血液分析仪检测不同组外周血血细胞数量的变化、流式多因子检测试剂盒检测血清细胞因子谱的变化、细胞增殖检测试剂盒（EdU法）检测骨髓造血细胞（LK细胞）的增殖能力、实时荧光定量RT-PCR检测LK细胞中转录因子的表达水平，分析BCG感染对细胞因子分泌和骨髓造血功能的影响。

此外，为了模拟粟粒性肺结核感染时MTB持续感染的状态，我们建立了另一种大剂量BCG入血感染联合结核抗原持续刺激的小鼠模型。将6～8周龄C57BL/6小鼠尾静脉注射5×10 ⁷  CFU/ml的BCG，然后每周皮下注射重组结核融合蛋白ESAT6-CFP10（10 μg）和MTB 10.4-HspX（MH; 10 μg），持续4周。同时将注射PBS的小鼠用作空白对照。于感染5周后检测外周血血细胞计数、血清中IL-7、IFN-γ、TNF-a水平和淋巴系祖细胞的百分比。

3.rAAV2-IL-7的治疗策略：在大剂量BCG联合抗原持续刺激组小鼠感染BCG后1周，腹腔注射5×10⁸ PFU/100 µl的重组IL-7基因的腺相关病毒（rAAV2-IL-7)。将rAAV2-EGFP处理小鼠作为对照。在BCG感染5周后检测外周血血细胞计数、血清中细胞因子分泌及骨髓淋巴系祖细胞百分比。

研究结果

1. 粟粒性肺结核患者的血细胞数量变化：104例粟粒性肺结核患者中有24例（23.08%）出现白细胞减少，80例（76.92%）出现淋巴细胞减少[即淋巴细胞百分比（淋巴细胞计数/白细胞计数）< 20%]；55.77%的患者出现淋巴细胞计数降低（淋巴细胞计数<1.5×10⁹/L）。此外，将中性粒细胞百分比（中性粒细胞计数/白细胞计数）>70%定义为中性粒细胞增多症，而临床粟粒性肺结核患者中有74例（71.15%）出现中性粒细胞增多症。提示粟粒性结核病患者通常伴有淋巴细胞减少和中性粒细胞增多。

2. 大剂量BCG入血感染引起小鼠淋巴细胞减少：在卡介苗（BCG）感染5周和8周后，检测小鼠外周血血细胞计数的变化。结果显示：高BCG感染组白细胞、淋巴细胞、血小板计数均明显低于PBS组（P值均<0.05），中性粒细胞百分比明显高于PBS组和低于BCG感染组（P值均<0.05）。在BCG感染8周后，高BCG感染组白细胞、淋巴细胞、血小板计数均明显低于其他各组（P值均<0.05）。这些结果表明，高剂量BCG入血感染也可引起淋巴细胞减少，这与粟粒性肺结核患者的血细胞数量变化一致。

3. 大剂量BCG入血感染诱导高水平的IFN-γ和TNF-α：为了研究BCG感染引起的细胞因子变化，我们检测了血清中细胞因子谱的改变。结果显示，在BCG感染3周后，大剂量BCG入血感染诱导的IFN-γ和TNF-α水平均明显高于PBS组（P值均<0.01），GM-CSF和IL-22水平均低于PBS组。而与第3周相比，高BCG感染组IFN-γ水平在第4周逐渐下降，而其他细胞因子水平均未见明显变化（图1）。

图1  大剂量BCG入血感染诱导细胞因子谱的变化。在BCG感染小鼠后的第1、2、3和4周，分别检测血清细胞因子谱的变化。A：细胞因子表达水平热图。高分泌水平的细胞因子（红色）和低分泌水平的细胞因子（绿色）。B：发生显著变化的细胞因子（包括IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-22）。P.I.：感染后。每组3～4只小鼠。*：P<0.05，**：P<0.01

4.大剂量BCG入血感染降低了骨髓中LK细胞的增殖活性：为了研究造血功能是否受损，我们检测了LK细胞的增殖活性。结果显示，在BCG感染后3周，高BCG感染组LK细胞的增殖率[（17.76±5.71）%]明显高于PBS组[（4.85±2.95）%]（P<0.01）。而高剂量BCG感染组与PBS组中LK细胞增殖率的差异在感染后5周和8周均逐渐减小 (图2)。提示大剂量BCG入血感染降低了LK细胞的增殖活性。

图2  大剂量BCG入血感染降低了LK细胞的增殖活性。在BCG感染小鼠后3周、5周、8周，磁珠分选LK细胞，检测LK细胞的增殖活性。A：LK细胞的流式细胞术分析。B：LK细胞中EdU阳性细胞的比例。a：与PBS组相比，P＜0.05；b：与低BCG感染相比，P＜0.05，每组5只小鼠

5.大剂量BCG入血感染调节LK细胞分化相关转录因子的表达： 在BCG感染后5周，检测了LK细胞分化相关转录因子的表达情况。结果显示，与PBS组相比，高BCG感染组髓系分化相关转录因子Batf2和IRF8的表达水平均显著上调，而淋巴系分化相关转录因子GATA2和NOTCH1的表达水平均明显下调（图3）。提示大剂量BCG入血感染可促进髓系分化，抑制淋巴系分化。

图3 大剂量BCG入血感染调节LK细胞分化相关转录因子的表达。在BCG感染后5周，磁珠分选LK细胞，用qRT-PCR检测LK细胞中转录因子Batf2、IRF8、GATA2、NOTCH1 mRNA的表达情况。每组5只小鼠；*：P<0.05，**：P<0.01

6. rAAV2-IL-7治疗可部分逆转大剂量BCG联合结核抗原刺激诱导的淋巴细胞减少：在BCG感染后1周，每周用结核抗原EC和MH持续刺激小鼠，持续4周，5周后检测外周血血细胞计数的变化。结果显示，高BCG联合抗原持续刺激组淋巴细胞百分率[（60.06±4.58）%]低于PBS组[（77.49±3.13）%]（P<0.05），而中性粒细胞百分比明显高于PBS组。这些数据表明，大剂量BCG联合结核抗原刺激可引起淋巴细胞减少，这与大剂量BCG感染模型和粟粒性肺结核患者的结果一致。

为了研究IL-7治疗能否逆转淋巴细胞减少，我们使用rAAV2-IL-7治疗小鼠后，检测外周血细胞计数的变化。发现rAAV2-IL-7治疗组淋巴细胞百分率[（60.28±1.77）%]高于rAAV2-EGFP治疗组[（49.98±4.89）%]（P<0.05），而中性粒细胞百分比[（30.41±1.61）%]低于rAAV2-EGFP治疗组[（38.48±6.87）%]（P<0.05）。说明rAAV2-IL-7治疗可部分恢复淋巴细胞的数量，提示IL-7可部分逆转大剂量BCG联合结核抗原刺激诱导的造血功能异常。

7. rAAV2-IL-7治疗有助于维持大剂量BCG联合结核抗原刺激小鼠IFN-γ和TNF-α产生的稳态：为了研究大剂量BCG联合结核抗原刺激是否诱导细胞因子分泌的改变，我们检测了血清中IL-7、IFN-γ和TNF-α水平的变化。结果显示，高BCG联合抗原持续刺激组IL-7水平[（274.3±32.40）pg/ml]显著低于PBS组[（324.4±14.67）pg/ml]（P<0.01），而IFN-γ和TNF-α水平均高于PBS组。提示大剂量BCG联合结核抗原刺激减少了IL-7分泌，增加了IFN-γ和TNF-α的产生。

IL-7干预治疗后，rAAV2-IL-7治疗组的IL-7水平[（318.8±7.35 ）pg/ml]高于未治疗组[（274.3±32.40）pg/ml]和rAAV2-EGFP对照组[（288.1±14.57）pg/ml]（图4A）。此外，rAAV2-IL-7治疗组血清IFN-γ和TNF-α水平均明显低于未治疗组和rAAV2-EGFP组（图4B、4C）。所有数据提示，rAAV2-IL-7治疗有助于维持大剂量BCG联合结核抗原刺激小鼠体内IFN-γ和TNF-α分泌的稳态。

图4  rAAV2-IL-7治疗增加了IL-7的分泌水平，降低了IFN-γ和TNF-α的水平。用rAAV2-IL-7或rAAV2-EGFP干预高BCG联合抗原刺激组小鼠，在感染后5周，检测血清中IL-7、IFN-γ、TNF-α水平。A：IL-7的水平；B：IFN-γ水平；C：TNF-α的水平。每组4～6只小鼠，**：P<0.01

8. rAAV2-IL-7治疗增加了大剂量BCG联合结核抗原刺激诱导的淋巴系祖细胞比例：在IL-7治疗后，检测骨髓中淋巴系祖细胞的比例。结果显示，与PBS组（2.29±0.68）相比，大剂量BCG联合结核抗原刺激组淋巴系祖细胞的百分比（0.56±0.11）降低。而rAAV2-IL-7治疗后，淋巴系祖细胞的百分比[（4.46±1.04）‰]显著高于未治疗组和rAAV2-EGFP组[（1.58±0.48）‰]（P值均<0.05），甚至高于PBS组（P<0.05）（图5）。这些结果提示IL-7治疗可恢复大剂量BCG联合结核抗原刺激引起的造血功能受损。

图5  rAAV2-IL-7治疗恢复了大剂量BCG联合结核抗原刺激诱导淋巴系祖细胞的比例。在BCG感染后5周，分离骨髓LK细胞，用流式细胞术测定淋巴系祖细胞（Lineage-c-Kit⁺CD127⁺细胞）的比例。A：淋巴系祖细胞的流式细胞术分析；B：淋巴系祖细胞的比例。每组5～6只小鼠，*：P<0.05

研究结论

大剂量分枝杆菌抗原持续刺激诱导IFN-γ和TNF-α的持续产生，这可能影响造血功能并导致淋巴细胞减少。IL-7通过降低IFN-γ和TNF-α水平可逆转造血功能受损和淋巴细胞减少。

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