无法解释的非特异性条带

做了两轮PCR反应，第二轮还是巢式PCR，引物也用Oligo 和blast 检验了特异性。

但是做出来还是有非特异性条带，切胶纯化以后做qPCR居然还有非特异性条带。我真的无语了，是在是不知道怎么回事。前两轮的PCR反应也试过梯度PCR，温度高了非特异性条带还在和目的条带一起变暗了；循环数也改了，20，25，30但都还是有非特异性条带。问老板，老板一口咬死别人（合作项目的实验室）做出来只有一条目的条带，但没图只有嘴硬。因为要做二代测序，大量的非特异性条带会影响最后测序结果和分析，如果在最后一轮加接头引物的PCR反应之后跑电泳，切胶回收，老板又嫌弃效率太低果断拒绝。真的不知道到底该怎么办。