基于液相色谱-串联质谱法的轻症和重症急性胰腺炎差异的血清代谢组学研究

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种常见的急腹症，以持续性上腹部剧烈疼痛为典型临床症状，可伴有腹胀、恶心、呕吐等。近些年，AP的发病率逐年上升，每十万人中约有34人发病[1]。引起AP的因素有很多，常见的因素主要为胆石症和饮酒，其他因素包括：内镜逆行胰胆管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）、药物、高三酰甘油血症、感染、创伤等。目前发现的AP的发病机制有胰蛋白酶原激活、Ca2+超载、内质网应激、线粒体功能障碍、自噬受损，其中胰蛋白酶原激活被认为是AP的一个非常重要的发病机制。胰酶的异常激活能够消化胰腺及其周围器官，产生局部胰腺炎性反应，病情进一步进展可能导致多器官功能衰竭[2]。根据2012年修订版亚特兰大分类（RAC）标准，AP可分为轻症急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）、中重症急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）[3]。MAP不伴有器官功能衰竭和局部或全身并发症，通常在2周之内恢复，病死率极低；SAP常伴有持续性器官衰竭，病死率极高，可超过30%[4]。大多数AP患者属于MAP，具有自限性，通常在1周内痊愈。有研究表明，约15%的AP患者首次入院时表现为MSAP或SAP[5]，伴有胰腺或胰周组织坏死或器官衰竭，或两者兼而有之，病死率达20%~40%[6]，对于可能进展为SAP的AP患者，早期识别和诊断并采取及时有效的治疗措施对改善患者预后和降低患者病死率均具有重要意义。实验室检查指标如C反应蛋白、尿素氮、血细胞比容与AP严重程度存在一定相关性，但是其准确性欠佳，临床上采用的多种评分系统如急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHE Ⅱ）、急性胰腺炎严重程度床边指数评分也存在一定的不足[7]。代谢组学旨在对参与疾病代谢的小分子物质进行研究，其价值在于从传统的寻找疾病诊断和预测的生物标志物进展为寻找异常的代谢通路。代谢组学能够对相对分子质量<1 000的内源性代谢物进行全面测量，是了解生理和病理反应中已知的代谢通路和生物功能改变的一种有效方法[8]。本研究拟采用代谢组学筛选出MAP和SAP的差异代谢物，寻找异常代谢通路，探索区别MAP和SAP的潜在生物标志物，为SAP的早期诊断、治疗提供参考依据。

1　资料与方法

1.1　研究对象

选取2020年8月至2021年3月于湖南省人民医院住院治疗的MAP患者40例（MAP组）、SAP患者28例（SAP组）为研究对象。AP诊断标准：（1）上腹部持续性疼痛；（2）血清淀粉酶和/或脂肪酶浓度≥参考值上限的3倍；（3）腹部影像学检查结果显示符合AP影像学改变。上述3项标准中符合2项即可诊断为AP[7]。纳入标准：（1）符合RAC标准中MAP和SAP的诊断标准；（2）无其他严重的代谢性和免疫性疾病。排除标准：患有风湿免疫性疾病、肿瘤、肝脏和肾脏疾病等能够导致胰腺炎的疾病。

1.2　实验材料与仪器

甲醇（赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈（赛默飞世尔科技中国有限公司）；蒸馏水（屈臣氏集团）；EP管（湖州中锐精密科技有限公司）；液相色谱质谱联用仪（美国Thermo Scientific公司）；液相质谱分析仪（美国Bruker公司）；G-560E型漩涡振动器（美国Thermo Scientific公司）；低温高速台式离心机（广州吉迪仪器有限公司）；-80 ℃超低温冰箱（山东博科科学仪器有限公司）；医用冰箱（山东博科科学仪器有限公司）。

1.3　样本采集与处理

1.3.1　样本采集

采集所有患者入院时静脉血，离心取血清。

1.3.2　样本处理

取患者血清100 μl，加入10 μl内标（0.3 mg/ml的L-2-氯苯丙氨酸，甲醇配制），涡旋震荡10 s；加入300 μl蛋白沉淀剂甲醇-乙腈（2∶1，V/V），涡旋震荡1 min；在冰水浴中超声提取10~15 min；于-20 ℃冰箱中静置30 min；于4 ℃条件以13 000 r/min速率离心15 min，取200 μl上清液，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS）进行分析。

1.3.3　质控品的制备

质控用于评价进样前的仪器、色谱质谱系统和实验过程中系统的稳定性，确保得到的实验数据真实可靠。68份样本各吸取10 μl并置于EP管中，涡旋混匀10 s，从EP管中依次吸取100 μl分装为6管（多余的液体弃掉），其余步骤按照1.3.2样本处理的方法进行处理。

1.4　LC-MS分析

以高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）作为代谢物分离检测平台，研究MAP组与SAP组患者血清样本的代谢物差异，在质谱正、负离子模式下收集数据；高效液相色谱条件：AcclainmTMRSLC120-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），柱温保持在40 ℃，进样量3 μl。流动相A为0.1%（体积分数）甲酸/水（含2 mmol/L甲酸铵），流动相B为0.1%（体积分数）乙腈/水，梯度设置：2%B持续0~2 min，50%B持续2~12 min，90%B持续10~30 min，98%B继续持续30~60 min；流速维持在400 μl/min；质谱条件为：电喷雾离子源（electrosprayion source，ESI±），采用正、负离子模式检测，使用高纯N2辅助喷雾电离与脱溶剂，流速为1.2 L/min，扫描质荷比范围为20~1 000 m/z，干燥气温度为200 ℃。

1.5　数据处理

1.5.1　数据预处理

通过Metaboscape 3.0软件对原始数据进行峰提取、除噪、标准化、导出等预处理，再将数据上传至人类代谢组数据库（HMDB）进行匹配，最后得到代谢物的保留时间、质荷比、峰值等信息。

1.5.2　数据统计学分析

将通过预处理得到的数据导入MetaboAnalyst 5.0进行分析，首先对数据进行归一化处理，使分析的数据呈正态分布，以排除个体间差异和外界多重因素的影响，使各代谢物之间在数值上具有一定可比性；采用单变量统计学分析方法〔t检验与差异倍数（FC，即在两组间代谢物相对含量差异的倍数）相结合〕，以P<0.05，FC>1.5为标准筛选MAP组与SAP组患者血清样本的差异代谢物。通过主成分分析（principal component analysis，PCA）对数据进行概述和离群值检测；然后构建偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）模型进行分类，并通过K折交互验证和100次置换检验对模型进行评价，了解模型的可靠性；通过PLS-DA得到变量权重值（variable important in projection，VIP），以VIP>1.0筛选潜在的差异代谢物；通过聚类分析评价不同代谢物的相关性及聚类程度；最终将得到的差异代谢物进行代谢通路分析，并结合受试者工作特征（ROC）曲线分析差异代谢物对MAP和SAP的鉴别诊断价值。

2　结果

2.1　质控验证

为了检验仪器的稳定性和实验的重复性，对本次实验6份质控样本进行了验证，验证结果提示6份质控样本的偏差均在2 SD范围内，说明仪器的稳定性和实验的重复性均好，实验数据稳定可靠且能反映不同组别之间代谢组学上的差异。

2.2　单变量统计分析结果

采用火山图显示两组患者血清样本的差异代谢物。在正离子模式下，筛选出41种差异代谢物（图1A，本文所有的图来源于

https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml ）；在负离子模式下，筛选出30种差异代谢物（图1B）。

2.3　多变量统计分析结果

2.3.1　主成分分析结果

在正、负离子模式下，两组患者血清样本的代谢物组内差异比较小，而组间差异较明显（图2A、B），说明代谢物信息特征能够区分MAP和SAP患者血清样本，即两组代谢物轮廓存在明显差异。

2.3.2　PLS-DA结果

利用PLS-DA方法对两组患者血清标本的代谢物轮廓进行分析，结果见图2C、D，正、负离子模式下，两组代谢组学存在明显差异。

2.3.3　模型拟合效果评价

对构建好的模型进行K折交互验证以评价模型拟合效果，以R2评价模型的解释度，Q2评价模型的预测值，正离子模式下，R2、Q2分别为0.949、0.745；负离子模式下，R2、Q2分别为0.967、0.795，R2、Q2均>0.5，说明模型拟合效果好，再对模型进行100次置换检验，得到的P值均<0.1，提示不存在过拟合的情况。

在成功构建正、负离子模式下MAP与SAP患者血清样本的代谢物模型下，进一步根据VIP筛选潜在的差异代谢物，在VIP>1.0的条件下，在正离子模式下筛选出差异代谢物31种，在负离子模式下筛选出差异代谢物19种。

2.3.4　聚类分析结果

对MAP组与SAP组患者血清代谢组学数据进行聚类分析，结果显示在正、负离子模式下，两组患者的血清代谢物均呈现出较为明显的聚类，见图3。

2.4　差异代谢物及代谢通路分析结果

2.4.1　MAP与SAP患者血清代谢物分析结果

正离子模式下有31种差异代谢物，其中升高的有18种：2，5-二甲基呋喃、龙胆紫、3-亚磺基丙氨酸、肾上腺素乙醇酰胺、2-吡咯烷酮、P物质、对乙酰氨基酚、LysoPC_20:1_11Z_、去氮芥、氯乙胺、四氢脱氧皮质酮、赤藓醇四硝酸酯、3-羟基丁酸、六氟异丙醇、铌、N-乙酰鸟氨酸、赖氨酸、脱氧胆酸；降低的有13种：原黄素、葡萄糖6-磷酸、8-羟基韦拉平葡萄糖醛酸、二氨基庚二酸、S-3，4-二羟基丁酸、乙醇胺、葡萄糖基半乳糖基羟赖氨酸、焦磷酸法呢酯、3-甲基-2-氧代戊酸、3-羟基苯甲酸、5-氟尿苷、壬酸、磺胺乙酰胺。

负离子模式下有19种差异代谢物，其中升高的有7种：膦甲酸、2-苯基-1，3-丙二醇单氨基甲酸酯、甜菜碱、rac-5，6-环氧-视黄酰-β-D-葡糖醛酸、乙酰胆甾醇葡萄糖醛酸苷、3-甲基-2-氧代戊酸、4-乙烯基苯酚硫酸盐；降低的有12种：NNAL-N-葡萄糖醛酸、根皮素2_-O-葡糖苷酸、七氟烷、马拉硫磷二羧酸、坎利酮、2-氧精氨酸、三氟乙酸、苯海拉明N-葡萄糖醛酸、O-去甲基曲马多葡糖苷酸、

4_-O-methyl-_-_-epicatechin-7-O-beta-glucuronide、DG_18:1_11Z_20:5_5Z，8Z，11Z，14Z，17Z_0:0、4_-O-methyl-_-_-epicatechin-3_-O-beta-glucuronide。

2.4.2　差异代谢物的代谢通路分析

利用MetaboAnalyst 5.0对在正、负离子模式下筛选出的差异代谢物进行代谢通路分析。依据KEGG数据库，匹配到了19条代谢通路，再以-log（P）>0.5且通路影响因子（pathway impact）>0.05筛选出5条代谢通路，分别为：牛磺酸和亚牛磺酸代谢，赖氨酸降解，淀粉和蔗糖代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，萜类骨架生物合成，见表1。

2.4.3　差异代谢物对MAP和SAP的鉴别诊断价值

对筛选出来的50种差异代谢物进行分析，筛选出其中ROC曲线下面积（AUC）>0.9的差异代谢物共8种，其对MAP和SAP的鉴别诊断价值见图4和表2。

3　讨论

本研究基于LC-MS技术对MAP和SAP患者的血清差异代谢物进行研究，共发现了50种差异代谢物，5条代谢通路，其中8种差异代谢物具有较高的鉴别诊断效能，与MAP相比，在SAP患者中表达升高的有：2-苯基-1，3-丙二醇单氨基甲酸酯、rac-5，6-环氧-视黄酰-β-D-葡萄糖醛酸、六氟异丙醇、赤藓醇四硝酸酯、3-羟基丁酸、四氢脱氧皮质酮；表达下调的有：苯海拉明N-葡萄糖醛酸、NNAL-N-葡萄糖醛酸。

XU等[9]通过超高效液相色谱-高分辨质谱分析技术对MAP患者与正常人的血清差异代谢物进行分析，筛选出了12种差异代谢物，其中辛酰胆碱的诊断效果最好，而本研究中MAP与SAP患者的差异代谢物中未发现胆碱类代谢物，提示胆碱类代谢物可能不是一个很好的鉴别MAP与SAP的差异代谢物。也有研究通过气相色谱-质谱（GC-MS）和随机森林算法寻找胆汁性急性胰腺炎（BAP）、高脂血症性急性胰腺炎（HLAP）和酒精性急性胰腺炎（AAP）的差异代谢物[10]，本研究所得结果与之相比，在AAP的差异代谢通路中也存在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路的异常，因此，过量饮酒可能通过这一条代谢通路导致AP进一步向重症化转变。也有研究通过GC-MS分析AP患者与健康体检者体内代谢产物的变化，发现3-羟基丁酸、磷酸、甘油、柠檬酸、D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、十六酸和5-羟色胺等是可以帮助临床诊断AP的潜在生物标记物[11]；本研究发现，3-羟基丁酸在SAP患者中的表达明显升高，SAP会导致患者组织和器官的进一步损伤，甚至导致器官衰竭，对于胰腺腺泡细胞来说，这种炎性反应会损伤线粒体功能，使ATP的产生减少，导致更多的乙酰辅酶A转化为酮体（乙酰乙酸、3-羟基丁酸和丙酮），从而使SAP患者中3-羟基丁酸水平升高[12]。

血清Ca2+的降低通常被认为与胰腺坏死有关，持续的低钙将导致患者出现多器官功能衰竭[13]。目前关于Ca2+在AP发病机制中作用的研究有很多，细胞内Ca2+超载和线粒体损伤能够影响胰腺腺泡和导管细胞功能，是AP进一步发展的关键致病步骤，细胞内高浓度Ca2+能够导致胰腺细胞ATP产生障碍，使胰腺细胞大量坏死，而胰腺细胞坏死将进一步导致胰蛋白酶的释放，最终引起大范围的胰腺炎症[14]。有研究发现，单氨基甲酸酯能够调控细胞内Ca2+浓度，通过阻断神经元中的T型Ca2+通道，防止细胞内Ca2+的过度聚集，从而起到保护神经的作用[15]。目前，尚未见关于单氨基甲酸酯在胰腺细胞中作用的研究报道，在本研究中，SAP患者血清2-苯基-1，3-丙二醇单氨基甲酸酯的表达明显升高，其是否也是通过该机制导致细胞内Ca2+的过度聚集从而导致胰腺的炎症尚需进一步研究。

葡萄糖醛酸是葡萄糖的C-6羟基被氧化为羧基后形成的糖醛酸，葡萄糖醛酸通过葡萄糖醛酸化反应生成高度亲水性的产物葡萄糖醛酸苷，葡萄糖醛酸苷通过胆汁或尿液排出[16]。在人体内，多种内源性物质（如胆红素）、药物和其他外源性物质（如环境毒素）通过与葡萄糖醛酸结合形成亲水性的物质从而更好地从体内排除[17]。因此，葡萄糖醛酸化反应是人类一种重要的防御机制，可以避免体内出现有毒物质的过度堆积。本研究表明，MAP与SAP患者的血清差异代谢物中，rac-5，6-环氧-视黄酰-β-D-葡萄糖醛酸、苯海拉明N-葡萄糖醛酸、NNAL-N-葡萄糖醛酸三种差异代谢物具有较高的鉴别诊断效能，其中rac-5，6-环氧-视黄酰-β-D-葡萄糖醛酸在SAP患者体内水平明显升高。

亚硝胺4（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）丁酮（NNK）是烟草中特有的导致肺癌的成分，在人体中，NNK可通过葡萄糖醛酸化反应生成NNAL-N-葡萄糖醛酸，从而通过尿液排出[18]，一旦这个代谢途径受到抑制，人体患肺癌的风险将增大。有研究表明，细胞色素P450 2A6（CYP2A6）能够催化NNK的代谢，从而降低肺癌的发病率[19]，也有研究表明，胰腺癌的发病与CYP2A6有关[20]。在SAP患者中，NNAL-N-葡萄糖醛酸表达下降，可能导致体内有毒物质如NNK的代谢障碍，有毒物质在体内大量堆积，从而进一步损伤患者的肺和胰腺组织，使重症患者出现更严重的临床症状，以后有望通过对此机制的深入研究，为临床早期诊断、治疗胰腺炎提供新的思路和方法。

综上所述，本研究通过对MAP和SAP患者的血清差异代谢物进行研究，发现了50种差异代谢物，5条代谢通路，其中8种差异代谢物具有较高的鉴别诊断效能，可能是区别二者较好的潜在生物标志物，后续可进行深入研究，从而为AP的诊断和治疗提供新的思路。

本文来源：黄湘平，吴玲，谭超超．基于液相色谱-串联质谱法的轻症和重症急性胰腺炎差异的血清代谢组学研究[J].中国全科医学，2023，26（9）：1118-1124.（点击文题查看原文）

HUANG X P, WU L, TAN C C. Serum metabolomic study on the difference between mild and severe acute pancreatitis based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese General Practice, 2023, 26 (9) : 1118-1124.

本文无利益冲突

参考文献略