宫颈恶性转化的序列基因表达分析发现RFC4是一种新的诊断和预后生物标志物

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背景

宫颈癌的发生是一个复杂的过程，是多种基因组改变的结果。已经进行了一些表达微阵列研究，调查这一过程中的转录组变化。然而，基于下一代测序的研究还很缺乏。

方法

1、从Gene Expression Omnibus（GEO）和ArrayExpress数据库下载GSE63514,GSE27678和GSE7803发现数据集以及GSE138080，GSE75132验证数据集。

2、组织标本（n = 420）来自Fanpu Biotech. Co. (FBC; Guilin, China)、同济医院妇科肿瘤科(TJH; Wuhan, China)和Outdo Biotech. 有限公司。

3、使用R软件包limma在病变和正常组织（分别为LSIL/HSIL/SCC与正常）之间进行差异表达基因（DEG）分析，并对DEG进行功能富集分析

4、对组织进行免疫组织化学分析，使用半定量组织学评分（HSCORE）系统评估SCC中的AURKA，TOP2A和RFC4染色。

5、对3个独立的SCC患者队列（TCGA，n = 252;TJH， n = 56;OBC，n = 106）进行生存分析。

6、计算皮尔逊或斯皮尔曼的相关系数以确定双变量相关性。数值变量采用学生t检验、威尔科克森秩和检验、单因素方差分析检验和克鲁斯卡尔-瓦利斯检验。

结果

1、宫颈病灶间和病灶内异质性评估

主成分分析（PCA）表明，GSE63514中正常和LSIL没有明显区分。然而，在其他数据集中，正常和其他疾病阶段之间存在明显的区别。不一致的结果可能是由于正常组织中的HPV状态不同。与未感染HR-HPV的正常上皮相比，LSIL与HR-HPV感染的正常上皮的相似性更高（图2A，附加文件1：表S1）。计算相应分期病例基因表达谱的成对相关系数，以测量病灶内异质性。在GSE63514中，我们观察到与HSIL，LSIL和正常相比，SCC的相关性显着降低（平均Pearson的r：0.91 vs. 0.94 vs. 0.94 vs. 0.93，所有p<0.05），反映了SCC的分子病灶内异质性。GSE7803也获得了类似的结果（图2B）。成对样本的相关热图表明无创鳞状上皮样本之间存在一定的相似性（图2C）。

图2

2、DEG鉴定和细胞带富集分析

为了进一步探索致癌过程中的转录景观，我们分别对LSIL，HSIL，SCC和正常组织（LSIL / HSIL / SCC 与正常：LN，HN，CN）进行了差异表达分析。LN中已确定的DEG数量有限，随后进展增加（图2D）。一方面，我们在HN和CN的发现数据集中观察到DEG的合理一致性表示，表明结果的可靠性。另一方面，GSE63514显示出最高的研究特异性DEG比例（HN：78.5%，CN：84.0%），其中约三分之一可以用平台特异性基因来解释（图2 E，F）。鉴于上述原因，我们应用“交叉研究”分析，为每个比较（包括LN_UP/DN、HN_UP/DN和CN_UP/DN，称为基因集1）分别生成上调和下调基因的联合，以组合来自多个独立微阵列数据集的数据。

基因集1的染色体图谱揭示了全基因组分布，具有高频染色体畸变的区域含有更特异性的DEG（图2G）。失调基因显著聚集在1q21、1q32、2q31、3q、8q13、12q13、17q21、19q13和19p13上，对应于先前报道的HPV整合或与宫颈癌相关的CNV区域。有趣的是，之前描述为扩增区域的1q21和19q13显示出下调基因的富集。在HN和CN中观察到富集的染色体条带3q13和19q13，在LN中仅观察到17q21（图2H，附加文件2：表S7）。

3、宫颈癌发生的功能和信号转换

基因集1和总DEG的GO富集揭示了HN和CN的相似富集模式。确定了八个不同的簇，每个簇都被分配了一个独特的富集特征（图3A）。我们观察到HN和CN的上调基因对细胞周期表现出强烈的富集（簇1，3，4）。细胞周期项的正向调控富含LN_DN、HN_UP/DN和CN_UP基因，表明细胞周期控制的动态调控。与整个疾病进展过程中角质形成细胞的不成熟一致，HN 和 CN 基因下调在角化项中显示出显着富集（第 8 类）。此外，LN_UP基因在任何方面均未富集，而LN_DN基因主要富集于簇1，5-8（图3A，附加文件2：表S8）。

图3

 总DEG的KEGG富集表明HN和CN之间非常一致。在下调基因富集时，HN似乎是一种过渡状态，因为HN的富集途径与CN和LN的富集途径部分重叠（附加文件1：图）。S3）。DNA修复途径[同源重组（HR），碱基切除修复（BER），核苷酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）]，细胞周期相关途径（细胞周期，DNA复制和细胞衰老）和致癌p53信号通路富含HN和CN的上调基因（图3B，附加文件2：表S9）。LN和HN的下调基因富集在更多的癌症相关通路（例如，MAPK，ErbB，PI3K / AKT，TGF-β和Wnt信号通路）中比CN富集。上述一些途径，如PI3K/AKT和Wnt途径，在考虑总DEG时也可以富集CN（图3B，附加文件2：表S9）。

人T细胞白血病病毒1（HTLV-1）感染和免疫相关IL-17信号通路在DEGs的所有疾病分期均富集（图3B）。富含HTLV-1感染信号传导的HN和CN的许多DEG是细胞周期相关基因，其中大多数是上调的。HTLV-1感染信号传导中的10个基因在LN中差异表达，所有血清反应因子（SRF）通路基因（SRF，FOS，FOSL1，EGR1和EGR2）均参与并下调（附加文件1：图）。S4，附加文件 2：表 S9）。IL17细胞因子家族包括IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17E（也称为IL25）和IL17F。在这些细胞因子基因中，只有IL17C在HN和CN中差异表达（下调）（图3C，附加文件2：表S9）。IL17C主要由角质形成细胞产生，在恶性转化中逐渐被异常上皮细胞取代。尽管Th17相关细胞因子基因（IL17A和IL17F）未受影响，但我们仍然观察到Th17细胞在癌症进展晚期的丰度显着降低（图3D），这与先前的发现不一致[41]。

4、鉴定与致癌作用相关的潜在基因

为了识别关键的DEG并为癌前病变的早期诊断和干预提供线索，我们应用“跨阶段”分析为每个发现数据集（称为Gene Sets2）生成DEG和“逐步基因”的交集。通过对Sets2基因的PPI网络分析，至少两个数据集中出现的四个基因（AURKA，TOP2A，CEP55和RFC4）被认为是“枢纽基因”（图4A，附加文件1：图）。S5）。在从正常到SCC的进展过程中，Hub基因表达显着增加（均p <0.05，附加文件1：图。S6），这也在GSE138080中得到了验证（所有p <0.05，图4B）。此外，这些基因已被证明参与几种不同类型的肿瘤的恶性转化，如巴雷特腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）等。正如预期的那样，他们倾向于显示肿瘤进展的线性表达模式（附加文件1：表S10）。

图4

观察到的疾病阶段依赖性表达变化可能由多种因素诱导，例如遗传和表观遗传改变，小RNA和HPV整合。本研究评估了AC和SCC中枢纽基因表达水平与相应拷贝数改变（CNA）之间的关联。我们发现 RFC4 的表达水平和 CNA 之间存在很强的正相关（斯皮尔曼的 rho：0.70 和 0.80，所有 p < 0.05），以及 AC 和 SCC 的 AURKA（斯皮尔曼的 rho：0.65 和 0.44，所有 p < 0.05）和 CEP55（斯皮尔曼的 rho：0.40 和 0.42，所有 p < 0.05）的中等相关性（图 4C）。TOP2A的CNA在促进基因表达变异性方面具有肿瘤亚型特异性作用。AC显示这两个参数之间的相关性比SCC更紧密（Spearman的rho：0.50对0.17，图4C）。

此外，我们在一项前瞻性队列研究（GSE75132）中检查了枢纽基因的表达水平是否可预测发生高级别宫颈病变。该研究招募了HPV阴性和持续感染HPV16的女性。HPV感染妇女根据随访期间是否进展到CIN3+分为进展组（HPV-P）和维持组（HPV-S）（附加文件1：表S1）。我们注意到HPV-P女性中RFC4和TOP2A的中位表达水平高于HPV-S和HPV阴性女性的趋势。HPV-P和HPV阴性女性之间的表达差异分别显著或略有显著（RFC4的p = 0.034，TOP2A的p = 0.08，图4D）。

5、HSIL和HSIL+枢纽基因的诊断评估

枢纽基因的分层聚类显示正常/ LSIL和HSIL+（HSIL和SCC）之间具有良好的分离（图5A）。因此，我们对p16进行了IHCINK4a、Ki-67 和四个枢纽基因，以验证蛋白质水平上鉴定的转录组变化，并探索其在诊断 HSIL 和 HSIL+ 中的临床实用性。对应于mRNA的变化，所有测试标记的蛋白质表达从正常逐渐增加到CIN3（图5B，附加文件1：表S11）。由于评分系统不同，我们无法通过IHC评分比较正常/CIN和SCC之间的标记表达。然而，根据主观视觉估计，鳞状细胞的肿瘤性上皮细胞比CIN3的肿瘤性上皮细胞表现出更强的染色（增加的阳性强度和更多的弥漫表达）（图5B）。

图5

细胞标志物根据其生物学功能分为三类，包括细胞周期调节标志物（p16INK4a，AURKA，RFC4），细胞分裂标记（CEP55）和增殖标记（Ki-67和TOP2A）。然后，我们开发了一个单独的评分系统来评估染色强度和程度（附加文件1：图。S7，表S5）。所有标志物的阳性率随着宫颈病变的严重程度而显著增加，特别是在HSIL和SCC中（图5C）。对于 p16INK4a和Ki-67，我们的结果与以前的研究非常吻合，这提高了对IHC可靠性和评估可比性的信心。同时，还收集了先前报道的宫颈病变中TOP2A和ProExC阳性（MCM2和TOP2A）的频率（附加文件1：表S12）。一致性分析表明，Ki-67和TOP2A在整个阶段的一致性为90.2%（κ = 0.8），HSIL的一致性为97.1%（κ = 0.84）（图5D，附加文件1：表S13）。

为了检测HSIL，六种标志物的灵敏度，特异性，PPV，NPV和AUC显示在附加文件1：表S14中。值得注意的是，具有高灵敏度和低特异性的CEP55和AURKA由于其细胞质染色而被排除在进一步比较分析之外，这使得评估具有挑战性和解释困难。为了统计比较其余标记物的诊断效用，分析了同时评估这些标记的切片（附加文件1：表S15，表1）。数据显示 p16 的灵敏度最高INK4a，但特异性和PPV较低。与 p16 相反INK4a，Ki-67 和 TOP2A 提供了几乎相同的灵敏度（92.6% 对 91.2% 对 88.2%，均 p > 0.05）和更高的特异性（63.4% 对 80.2% 对 87.1%，所有 p < 0.05）。加入Ki-67可以提高p16的特异性（87.1%对63.4%，p<0.05），PPV（82.2%对63%）和准确性（AUC，0.88对0.78）。INK4a（图5E），以牺牲灵敏度（92.6%至88.2%）和NPV（92.8%至91.7%）为代价。TOP2A的性能与p16相同INK4a和 Ki-67 组合。此外，RFC4不仅具有相同的灵敏度（88.2%对88.2%，p = 1 ）和相对更高的特异性（90.1对87.1%，p = 0.58），而且比p16的组合具有更高的准确度（AUC，0.89对0.88;图5E）。INK4a和 Ki-67。同时，RFC4和TOP2A检测HSIL+的诊断效果有所提高，AUC分别达到0.91和0.89（表1）。这些结果表明，单独的RFC4和TOP2A可能是p16的互补替代标记。INK4a和Ki-67用于检测HSIL和HSIL+。

此外，将任何标记对的串行和并行解释与单独的TOP2A和RFC4进行比较（附加文件1：表S16）。TOP2A 和 RFC4 在并行解释中的组合具有最高的准确度（AUC，0.90），与 RFC4 相比，检测 HSIL 的灵敏度显着更高（97.1 vs 88.2%，p < 0.05），但特异性较低（82.2 vs 90.1%，p < 0.05）。在检测HSIL+方面，没有一种组合比RFC4具有某些优势（附加文件1：表S16b）。

6、鳞状细胞癌枢纽基因的预后评估

为了进一步研究枢纽基因在SCC进展中的临床影响，我们检查了TCGA队列中鳞状细胞癌患者的表达与疾病严重程度之间的相关性。分析显示，AURKA mRNA表达增加与晚期FIGO分期（p = 0.039）、较高的组织学分级（p = 0.01）和淋巴结转移（p = 0.088;附加文件 1：图S8）。

接下来，我们评估了枢纽基因表达改变对三个独立SCC患者队列预后的影响（参见“方法”部分）。在TCGA队列（n = 252）中，高AURKA mRNA表达与OS呈负相关（log-rank，p = 0.017;图6A）。而较高的RFC4 mRNA表达与更好的OS和PFI显著相关（对数秩，分别为p = 6.8e−04和p = 7.8e−03;图6A，附加文件1：图。S9A）。为了在蛋白质水平上验证这一发现，我们对TJH队列（n = 56）的SCC组织对这些基因进行了免疫染色。RFC4蛋白的过表达与OS和DFS增加有显著关联（对数秩，分别为p = 3.1e−03和p = 1.5e−03;图6B，附加文件1：图。S9B）。此外，较高的TOP2A蛋白表达与更好的DFS显著相关（对数秩，p = 0.019;附加文件 1：图S9B），在mRNA水平上没有发现。虽然没有统计学意义，但在TCGA队列中，与PFI（对数等级，p = 0.1）增加和TJH队列中DFS（对数排名，p = 0.072）增加相关的CEP55表达有较高的趋势（图6B，附加文件1：图）。S9B）。由于TJH队列的样本有限，我们进一步研究了TJH和OBC联合队列中的RFC4预后值（扩展队列，n = 162;附加文件 1：图S10）。正如预期的那样，RFC4蛋白表达对OS和DFS的影响仍然显着（对数秩，分别为p = 1.6e−04和p = 2.2e−04;图6C，附加文件1：图。S9C）。鳞状细胞癌中枢纽基因的代表性IHC染色图像如图6D所示。

图6

值得注意的是，多变量Cox回归分析显示，在调整年龄、FIGO分期、分级和队列后，RFC4表达（mRNA和蛋白质）成为三个队列中SCC患者临床结果（OS、PFI和DFS）的独立预测因子（图6E，附加文件1：图）。S9D）。时间依赖性AUC表明，在Cox比例风险模型中加入RFC4表达显著提高了2年和3年OS的预后有效性（均p <0.05; 图6F），对于1年、2年和3年DFS（均p < 0.05;附加文件 1：图S9E）。

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