跟着纳米抗体去漫游（一）

以下文章来源于兴至杂谈 ，作者顾洪专

纳米抗体（nanobody）是Ablynx注册的商标，现在用来指代单域（single domain antibody，sdAb）。因为它，这三十年来世界有越来越多的人以采集骆驼，鲨鱼的血为生（bushi）。

1960年“现代免疫学”bernet获得诺奖，1972年的诺奖颁给了抗体结构的发现，1975年杂交瘤技术的出现引爆了抗体研究的“一浪”时代。80年代初期利川跟进在bernet创建的巴塞尔研究所进行抗体多样性的研究，1984年诺奖授给了杂交瘤技术，1986年第一个抗体药（OKT3）获批，1987年诺奖授给了利川跟进。

1988年，Genetech利用杂交瘤技术发现了Her2的鼠源抗体，但是当时业界冒进的化药管线的诸多临床失败影响了公司对这个抗体药的信心：

“在加州大学洛杉矶分校，斯拉蒙陷入了孤军奋战的境地。他虽然不是基因泰克公司的员工，却殚精竭虑地要支持Her-2的研究。基因泰克公司的医学主任约翰·柯德（John Kurd）回忆说：“除了他，没有人在乎这个项目。”斯拉蒙在基因泰克公司饱受白眼，但他一意孤行、死缠烂打，经常从洛杉矶坐飞机过来，蹲守在走廊里试图寻找任何对他的鼠抗体感兴趣的人。大多数科学家已经失去了兴趣。但依旧有一小群基因泰克科学家对他抱有信心，这些科学家怀念往日知难而上的开拓年代。” ——《众病之王-癌症传》

但这只是小小的挫折，在当时抗体领域研究风潮正盛，某种程度上可以称之为“二浪”。大家都已经将注意力转向scFv，Fab这一类“更小”的抗原结合物中，噬菌体展示技术也是这个阶段的成果之一，发明者于2018年，第一个纳米抗体获得FDA批准之年，获得诺奖。

1989年，已经发现了某些病理状况下存在单独重链或单独轻链的抗体，包括用于杂交瘤的骨髓瘤细胞（笔者在刚开始接触抗体测序工作之时，曾悄悄地把这些烦人的序列标记为“魔鬼序列”）。

纳米抗体的发现

这一年，比利时布鲁塞尔大学（VUB）Raymond Hamers教授指导一个学生实验项目，研究非洲锥虫病（昏睡病）病原体的血清测试方法。学生们害怕被感染，不肯测试人的血清，Serge Muyldermans 回忆说，他们还拒绝杀老鼠取血清测试，最后从冰箱里翻到了健康骆驼（来自北非摩洛哥的单峰驼）的血清，才开始做实验。但是学生们跑电泳的结果有点奇怪，除了正常抗体的条带，还有一些分子量偏小的条带，老师第一时间觉得肯定是这帮学生做实验不靠谱，只好亲自动手重复......后来他们从动物园里双峰驼、羊驼血液里都发现了这种小型抗体，最初的结果发表在1993年的《Nature》上。

他们发现除了4条链组成的常规抗体（IgG1），还存在两种只有两条重链的抗体，而且占总IgG含量的75%。后来他们继续测试这种单链抗体在新世界骆驼（大小羊驼）体内占IgG总量略少，大约30%-50%。

后来，经过更仔细的研究，发现这种重链抗体有这几个特点：

a. 没有CH1结构域, b. 分IgG2与IgG3（长短铰链区）两种；c. 框架区2（FR2）中的特异性保守氨基酸替代（V37F/Y, G44E, L45R,  W47G，Kabat编号），主要是经典抗体中与VL接触的位置；d. 与常规抗体的重链相比，CDR3长度和氨基酸种类都更多样化。

1994年，他们把这种抗体称为VHH用以区分于正常的VH。

1995年Flajnik和同事在猫鲨科温顺的护士鲨血液中发现了类似的单重链抗体。

到2000初，VUB获得的一系列VHH的专利，后来转到VIB（ Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie ），2002年，VIB创立孵化了Ablynx。

纳米抗体的起源

现存的骆驼科6个成员旧大陆骆驼（双峰驼，单峰驼）和新大陆骆驼（美洲驼、原驼、羊驼和骆马）体内都有纳米抗体，但同为偶蹄目且进化关系较近的猪形亚目、反刍亚目（牛，长颈鹿，羚羊）和鲸河马亚目体内都没有。

这说明目前骆驼的共同祖先演化出了纳米抗体，胼足亚目是第一个与其他偶蹄目成员分开的，大约在5千万年前始新世中期（距今5,200万∼4,360万年）在北美洲独立演化。亚洲骆驼的初乳中IgG含量高达50+mg/mL，常乳中IgG含量（3.2mg/mL）也远高于牛常乳（0.47mg/mL）和马常乳（0.39mg/mL）。或许将来，孩子们每天都能喝上骆驼奶也说不定。

鲨鱼纳米抗体的演化史可能十倍于骆驼科纳米抗体，大约4.5亿年前的奥陶纪，演化于部分软骨鱼和鲨鱼的祖先，甚至早于肺的进化。

纳米抗体有何特别

这种特别指的是与传统单克隆抗体（H+L）进行对比，这种区别可以分成三类，一类是操作方便性类的，一类是其结合机制类，还有就是其局限。

操作方便类也是提到纳米抗体的优势时，狭义上的那一些，包括：

• 不存在轻重链配对问题，分子操作简单，因此在噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示中均可以高效应用;
• 可以很方便地进行原核表达，并且产量很高，因此生产成本很低；
• 热稳定性高，可以重复折叠恢复构象
• 抗体序列与人VH3家族高度同源，便于开发治疗型用途

结合机制类包括：

• 表位偏好与H+L抗体不同：更偏向于稳定结构区而非loop，偏向于沟沟坎坎

• 
  
• 在胞内还原性环境中正常折叠与结合

纳米抗体的局限主要有：

• 清除较快，体内半衰期大约20min到半小时，这一点对于特定用途比如成像或者核素标记抗体不算缺点；
• 安全性需要更多验证，虽然序列同源性比鼠源抗体更高，但临床数据积累还不够
• 难以进入细胞，这一点和H+L抗体一样，但是纳米抗体进入细胞内一般可以继续结合（H+L抗体一般需要以scFv的形式经过改造和筛选才能做到），因而纳米抗体对进细胞的需求更大。

纳米抗体的用途

目前纳米抗体的主流用途包括作为科学研究的基础工具，诊断和成像以及疾病治疗。

作为科研的基础工具，纳米抗体可以融合E3链接酶的活性部分，在细胞内特异性地降解靶蛋白，这方面的科学研究和商业竞争如火如荼；可以用于稳定靶分子的构象，进而解析结构，比如2012年诺奖化学奖得主就用亲和力pM级的纳米抗体帮忙解析了GPCR的晶体结构。

作为诊断或成像的工具，纳米抗体可以连上特定的tag，荧光蛋白或者核素。未来，首先纳米抗体会扩展到田间地头这种需要更稳定的检测试剂的应用场景，而后低成本、高亲和力、高度一致性的纳米会占领各种诊断市场（那些目前被多抗、单抗所占据的市场）。

作为治疗分子，纳米抗体在多抗、膜表面效应分子（如CAR-T/NK类分子）、胞内抗体（蛋白穿膜或者DNA/mRNA膜内表达）以及吸入抗体、跨血脑屏障抗体等领域都会得到广泛应用。

如何发现纳米抗体？

目前主流的抗体发现技术有：杂交瘤技术，噬菌体展示技术和单B细胞技术。

噬菌体展示是最成功、目前应用最广的技术，一般认为噬菌体展示的库容上限是1010,其开发之初是为了做H+L抗体，但直到现在只有很少团队克服轻重链配对的问题，因此想利用超大库容去做H+L抗体其实是一种“泥潭技术”（我用这个名词来指代某些听起来很光鲜亮丽，但最好只放在口头上当广告，如果把身价性命压在上面是替业界整体做嫁衣，自己会破产的技术）。直到目前，绝大部分开发的纳米抗体都来自于骆驼y免疫加噬菌体展示筛选。

用杂交瘤做纳米抗体筛选的困难之一是改造/发现合适的骨髓瘤细胞，其二是该技术本身的成本（包含时间）较高，且浪费纳米抗体可以高效原核表达的优势。单B细胞目前技术路线还未统一，绝大部分的通量和成本依旧存在问题，目前从biotech的角度，也还是一个“泥潭技术”（除非有钱到给以足够做成功的资源到能够做成功的团队手中），如果只是概念验证性的尝试，可以做等等党，让别人去靠这个技术打广告吧（毕竟biotech是有拿出真东西的紧迫性的）。

做天然库结合合成库的方式是我认为的必经之路，将天然库提供的多样性结合合成库可以提前设计的骨架可开发性（比如稳定性，表达，pH-dependent，+/-二硫键）建立不同的分库。库的多样性不仅通过序列的差异，还要考虑整体所涵盖的结合能力范围，或者说所能提供的最大相邻可能值，以支持该库面对各种不同抗原时都有可以与之或强或弱结合的分子，虽然从实用和计算角度都能大概得到单一成年人的天然免疫库的多样性已经可堪大任，但是设计合成文库的方式可以通过高通量测序进行进一步的补强，或许是跨物种地进行补强。

为了支持这种天然-合成库的筛选，需要在两方面进行补强：其一是由于这种类型的文库，库容一般大于1012,需要使用比噬菌体展示库容更大的无细胞展示技术（核糖体/mRNA/cDNA展示）进行初筛，而后使用噬菌体展示/酵母展示/哺乳动物细胞展示进行复筛；其二是由于缺乏体内的复筛以及亲和力成熟过程，需要在体外建立成熟的定向进化方法以及体外和体内的免疫原性评价模型（这一点对于任何抗体，即使全人源抗体，都十分必要）。

在2012年前后纳米抗体专利到期之前，一些团队开发了用于纳米抗体发现的转基因鼠，重点解决了人源化的问题。但是今天看来这也是一项“泥潭技术”，因为转基因鼠的构建不像合成库的设计，反馈周期很长，因此基因框架的选择非常重要，选择不好可能丢失纳米抗体的理化性质优点；而且转基因动物提供了抗体负性筛选和亲和力成熟（有效性存疑）的同时，也造成了多样性的系统性偏差式的缺失，就使得纳米最重要的优点（更丰富的多样性、更高频的体细胞突变）丢失。

结语

对于喜欢把事物分一二三的人，会将纳米抗体称作“第三代抗体”，对应于第一代单克隆抗体，第二代抗体片段（scFv，Fab）。而纳米抗体的研究也可以大致分成三个阶段，第一阶段是90年代初的被发现，第二阶段是2012年前后许多专利到期，第三阶段是2018年第一个纳米抗体药物获批到现在。近几年双抗、多抗的进一步研究，新冠对全世界抗体发现平台的“大阅兵”，以及mRNA技术的快速进展，实际上进一步凸显了纳米抗体的重要性。

对于治疗性抗体开发，做纳米抗体不再单单是为了其方便属性，而是因为其结合特性与H+L抗体不同。针对特定的靶点，需要去找到最适合的结合位置与抗体，或许是纳米抗体或许是H+L。站在未来的某个时刻，说的话与此类似，“我们还做H+L抗体，是因为它结合特性与纳米抗体有差异”。

当下的生物科技或生物医药公司，如果还只靠杂交瘤技术这架马车拉着，或者靠某些“泥潭技术”给自己打广告和打鸡血，也许唯一利好的是没有Skin-in-the-gaming的药企中高层吧。

也许并不遥远的将来，我们早餐吃的坚果里表达了可口服的纳米抗体，抚摸着旁边吃猫草的猫咪，猫草的叶子里表达了降低猫咪致敏性的纳米抗体。

参考文献：

1. https://pdb101.rcsb.org/motm/136
2. Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases,Mitch Leslie
3. Single-Domain Antibodies-Methods and Protocols,2022
4. Camelid Single-Domain Antibodies: Historical Perspective and Future Outlook,2017
5. Camelid Single-Domain Antibodies: Promises and Challenges as Lifesaving Treatments, 2022