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RNA介导染色质相互作用的研究

金加

军事科学院

摘要：细胞核是真核细胞内最大的细胞器,是基因组的储存场所,是一种严格区室化高度不均一的亚细胞结构。染色质是基因组的存在形式,是细胞内最大的复合结构,是遗传和表观遗传信息的共同载体。染色质主要由DNA、RNA、组蛋白和非组蛋白等构成,人类细胞中长约两米的染色质,经过一系列的折叠,最终被压缩到直径约为10μm的细胞核内。染色质的折叠过程是高度有序的,首先DNA缠绕组蛋白八聚体形成核小体,然后四个核小体为一个单位经过折叠形成左手螺旋结构,这种螺旋结构再经过进一步的有序压缩,最终形成10 nm染色质一级结构、30nm染色质二级结构以及Mb尺度的、包括不同类型结构域的染色质四级或高级结构。Job Dekker在2002年发明的染色质构象捕获技术3C（Chromosome Conformation Capture）,为我们在更高分辨率条件下,了解染色质的高级结构、相互作用提供了有力支持,随后一系列3C的衍生技术4C、5C、Hi-C等的发展,更是为染色质高级结构等研究,提供了更全面的技术手段,相继发现,染色质存在更为精细的高级构象,依次为10-100 Kb尺度的染色质互作环（Loop）、亚拓扑学相关结构域sub TAD（Sub-Topological Associated Domain）、100-1000 Kb的拓扑相关结构域TAD（Topological Associated Domain）、核纤层结合结构域LAD（Lamina Associated Domain）、核仁结合结构域NAD（Nucleolous Associated Domain）等、染色质区室（Compartment）以及染色质领域（Chromosome Territories）等。研究发现,非编码RNA在染色质三维结构的形成中发挥重要的作用,如lnc RNA通过与蛋白或者其他RNA的结合,介导了染色质的相互作用,非编码RNA XIST紧密缠绕X染色体,然后通过一系列的级联反应,最终使得结合有XIST的X染色体逐步凝聚、压缩成失活状态。为了探究非编码RNA对染色质相互作用的整体影响,我们分别设计了体外人为添加RNase、体内瞬时诱导RNase的表达等不同策略去除RNA,同时结合Hi-C技术,以便系统、全面探究RNA特别是lnc RNA在染色质互作、三维高级结构的形成等过程中的作用。在体外人为添加RNase去除RNA的策略中,在细胞交联、裂解以后、开展Hi-C实验之前,通过RNase A处理与否Hi-C数据的比较分析,考察体外条件下RNA对染色质相互作用的影响。使用GM12878为材料,通过Hi-C实验以及高通量测序数据的一系列质控分析后,分别进行了染色质内、染色质间全基因组相互作用（秩和检验P＜0.05）、相互作用衰减指数IDE、染色质相互作用差异、TAD及边界强度以及A、B区室及其差异（Wilcox检验P＜0.05）等的全面分析,结果发现:无论RNase A处理与否,Hi-C文库质量较好,其中不处理与处理组相比,末端完全配对片段、有效作用片段、有效比对片段、唯一配对片段占比情况分别是:97.92%vs.98.43%、95.35%vs.95.09%、82.09%vs.74.10%、74.65%vs.73.52%,均满足质控要求。经RNase处理后,染色质远距离相互作用有所增加,近距离相互作用有所减弱。这一结果提示RNA参与构建、维持了染色质的局部结构,同时也可能参与了基因的表达调控;考虑到染色质局部结构的松散,会使得染色质远距离相互作用概率增加,进一步促使染色质整体结构变得相对松散,这也暗示了核内RNA在维持特定的远距离相互作用、保持基因组整体结构上起到了重要的作用。我们的结果还表明,虽然在体外RNase处理实验中,核内RNA对染色质三维高级结构有影响,但是总体上这种影响比较微弱,只是在X染色体上的影响较大。由于我们的实验是先交联、再体外使用RNase A处理、降解与染色质耦联的RNA来考察染色质耦联RNA对对染色质的相互作用的影响,本质上是一种体外实验,交联过程中绝大部分、特别是那些近距离的染色质互作已经被固定,因此RNase A处理前后,近距离的染色质互作应该变化不大。相反,部分远距离的、RNA参与介导的互作则会受到影响,因此染色体总体上变得疏松。由于失活X-染色体的高度凝聚、压缩中RNA发挥重要作用,即便是交联以后再用RNase处理,仍然会导致其互作发生明显的改变,因此我们的上述实验结果符合预期,也与国外报道一致。在体外RNase处理发现染色质耦联RNA对染色质互作发挥作用的基础上,随后我们尝试建立外源RNase活性可即时调控的体内遗传系统,以便在交联前瞬时激活RNase的活性、降解绝大部分胞内RNA,然后再进行交联、固定,从而在体内考察RNA对染色质结构的影响。基于此,我们首先成功构建了RNase A与活性受到小分子Shld-1调控的、来源于FK506的蛋白降解子DD融合的、表达受到四环素严格诱导的真核表达载体p Tet One-DD-RNase A,这样DD-RNase A只有在小分子Dox、Shld-1都存在下,才能表达、稳定存在并且发挥RNA降解作用,从而实现交联前的RNA瞬时降解。在此基础上,通过慢病毒转染,进行细胞系的构建。目前已经获得多克隆株,将多克隆株用q PCR检测RNase A的表达量、CCK8检测细胞活力,流式细胞计数法检测各组细胞的凋亡情况,最后结果显示DOX和DOX+shield I处理组RNase A的m RNA表达上调;DOX+shield I处理组细胞凋亡增加,细胞活力降低,细胞系初步构建成功。 还原关键词：染色质的相互作用;非编码RNA;Hi-C;DD;

• 专辑：基础科学
• 专题：生物学; 生物学
• DOI：10.27193/d.cnki.gjsky.2021.000098
• 分类号：Q343.2

导师：陈昭烈; 赵志虎;学科专业：细胞生物学硕士电子期刊出版信息：年期：2022年第03期网络出版时间：2022-02-16——2022-03-15