间充质干细胞来源小细胞外囊泡的生物活性评价

间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEV）对30多种疾病具有潜在的治疗作用。其中许多疾病，如心肌再灌注损伤、缺血性中风、急性肾损伤和急性移植物抗宿主病等，涉及缺血缺氧、氧化应激和炎症等复杂的病理过程。MSC-sEV携带蛋白、核酸、脂肪等不同的货物分子，具有多种生物学效应，是这些复杂疾病的理想治疗策略。

MSC-sEV具有广阔的临床应用前景，且无明显副作用，这些优点已在各种临床前动物模型和人体临床试验中被广泛报道。无细胞的MSC-sEV制剂可能比细胞类MSC产品更安全、更容易向临床转化，但仍然面临着如何证明其质量、安全和疗效的挑战，这也是任何医药产品向临床转化都需要解决的问题。

MSC-sEV是活细胞的产物，活细胞对外界微环境的变化很敏感，因此在MSC-sEV产品的研发过程中，必须指定用于评估MSC-sEV关键特性和活性特征的质量控制指标。MSC-sEV治疗疾病的作用机制是复杂的，并且对于不同疾病的作用机制不同，因此要找到理想的反映作用机制(MoA)的效力检测方法具有挑战性。

近年，包括国际囊泡协会发表的MISEV2018版指南在内的多篇文章提出了EV研究的最低实验要求、治疗用EV的定义、EV在不同疾病中的作用等，对EV药物产品的研发起到了积极的推动作用。其中，国际细胞与基因治疗学会（ISCT）外泌体科学委员会在2021年于《Cytotherapy》发表了“Critical considerations for the development of potency tests for therapeutic applications of mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles”，提出间充质干细胞来源小细胞外囊泡的效力试验需要考虑的关键因素，为EV药物研发提供借鉴。

​图1. 开发MSC-sEV制剂的效力测定。

MSC-sEV制剂主要来源于浓缩的MSC条件培养基，富含直径为50-200nm的sEV。MSC-sEV制剂的特性和效力在很大程度上受到其生产过程的影响，即MSC来源、培养系统和EV富集方法等。目前，要统一不同实验室的制备方案是不现实的，所以有人建议用一套参数来衡量用不同方案制备的MSC-sEV制剂的特性。虽然这些参数可以区分间充质干细胞和非间充质干细胞来源、确定EV的理化性质，但不能评估MSC-sEV对某种特定疾病的效力。理想的效力测定应能反映MSC-sEV治疗或减缓疾病的作用机制，且是定量的、灵敏的、准确的、稳定的。

对MSC-sEV的效力评价，应考虑到其在组织、细胞、亚细胞和分子水平上的时空生物分布，及生物活性与疗效之间的因果关系。MSC-sEV可以直接作用于受伤/患病的靶组织/细胞，也可以通过调节免疫细胞和抑制炎症反应间接发挥作用。阐明MSC-sEV作用机制的常用方法是分析其携带的可能介导治疗效果的候选RNA或蛋白质货物分子。

例如，Bruno等人报道了其制备的80nm-1000nm的MSC-EV可通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡保护甘油诱导的急性肾损伤，其生物学活性可能与CCNB1、CDK8和CDC6的mRNA，胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子等蛋白质生长因子，及miR-486-5p、miR-126 和 miR-34等 microRNA有关。因此，这种 MSC-EV制剂对急性肾损伤的效力测定方法可以选择实时定量聚合酶链反应，用来分析CCNB1、CDK8和CDC6的mRNA水平或microRNA（如miR-486-5p、miR-126 和 miR-34），也可以选择酶联免疫吸附试验等基于抗体的检测方法，用于分析胰岛素样生长因子 1 和肝细胞生长因子信号通路中的蛋白分子水平。

Lai等人报道了 110-130 nm 的 MSC-sEV通过降解变性蛋白质和激活AKT信号通路来增加ATP 合成，并减少氧化应激反应，进而减少心肌缺血/再灌注损伤。这些生物活性与 MSC-sEV内容物中与ATP生成相关的一些货物分子（如丙酮酸激酶、20S蛋白酶体和 CD73/ecto-5'-核苷酸酶等）有关。因此，检测这种 MSC-sEV 制剂对心肌缺血/再灌注损伤的效力可以是丙酮酸激酶、20S 蛋白酶体和 CD73 的酶促反应。

如上述两个例子所示，MSC-sEV的效力测定可能因不同疾病而异，并且对于相似的病理过程（例如，细胞凋亡）的检测方法也可能不同。这可能是由于 MSC-sEV的制备方案差异，导致富集的EV内容物成分不同。EV内携带的货物分子也存在功能冗余，其中不同成分可能具有相似的生物学活性，一种成分也可能发挥不止一种生物学活性。

MSC-sEV研究转化为医药产品是一个令人兴奋但具有挑战性的过程。科学、稳定、灵敏的效力检测方法将促进基于MSC-sEV 药物产品的临床测试，并加速药用 MSC-sEV 产品的临床转化。

参考文献：

1. Gimona M, Brizzi MF, Choo ABH, et al. Critical considerations for the development of potency tests for therapeutic applications of mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles. Cytotherapy. 2021, 23(5):373-380

2. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750.