外泌体血清血浆怎么提取?
外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质 的小囊泡(30-150 nm),在血清/血浆中大量存 在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能,在特 定细胞之间传递它们的效应物或信号分子。 外泌体的生物学功能研究中需要分离完整 的外泌体颗粒,宇玫博生物自主开发的血清/血 浆外泌体快速提取纯化试剂盒,组分经过优化处 理,适用于血清/血浆中的外泌体提取,可快速 高效地获得高纯度外泌体颗粒。
自备材料
高速离心机(可达到 12000rpm 转速),涡 旋振荡器;1.5 mL 离心管,PBS 缓冲液、制冰 机。
操作规程
一、样品预处理
1,离心机在使用前先于 4℃预冷 10min;
2,取样:如果是冻存样品,从冰箱取出后 于 2-8℃条件下进行解冻;如果是新鲜样品收
集样品后置于 2-8℃保存;
3,将样品按照 500 μL /管进行分装,不足部分用 1×PBS 补足至 500 μL。
样品类型 单管处理体积
血清/血浆 0.5 mL
二、去除杂蛋白
1, 从-20℃冰箱中取出 Solution A 置于碎冰上;
2,加 Solution A:在 500 μL 样品中加入400μL 预冷的 Solution A,立即将离心管紧,通过涡旋振荡器充分混匀 30 s;
3,离心去蛋白:将混匀后的样品于 4℃以12000 rpm 离心 20 min,去除样品中的杂蛋白;
4、上清液转移:去除杂蛋白的离心上清液转移至新的 1.5mL 离心管中;
三、提取外泌体
1,加 Solution B:在去除杂蛋白的离心上清液中加入 120 μL 的 Solution B;
2,溶液混合:加入 Solution B 试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器充分混匀 1 min;
再放置于室温下静置 5 min;
3,沉淀外泌体:将装有混合液的离心管于 4℃以 12000rpm 离心 10 min,弃上清;
4,再次离心:将含有沉淀的离心管再次于 4℃以 12000rpm 离心 2 min,弃上清(注:尽可能吸净上清液),并将 1.5mL 离心管于室温下敞口静置 10min;
5,外泌体重悬:取 200μL 的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物,待其溶解后,将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中;
6,收获外泌体颗粒:将含有重悬液的 1.5 mL离心管于 4℃以 12000rpm 离心 5 min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒;(注:此时可能有较多沉淀,为正常现象)
四、纯化外泌体
1,外泌体纯化:将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter(EPF 柱)上室中,于 4℃以 5600rpm 离心 20 min,离心后收集 EPF 柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒;(注:EPF 柱不可重复使用)
2,外泌体的保存:纯化后的外泌体以50-100 μL 进行分装保存于-80℃低温冰箱中,
以备后继实验使用。
五、储存条件
收到产品后将试剂分开储存,使用前请充分混匀。
Solution A:储存于-20℃条件下;
Solution B:储存于常温条件下;
EPF 柱:储存于常温条件下;
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 5483