小鼠原代成釉细胞培养

本人实验是提取1周龄的c57bl/6小鼠下切牙成釉器，培养原代成釉细胞。此时的釉上皮中含有不同分化阶段的成釉细胞。采用组织块培养法（之前本打算参考文献使用胶原酶消化成单细胞培养，后发现胶原酶消化后单细胞量极少，遂使用组织块培养法）

目前已有的成釉细胞/牙上皮细胞系包括：大鼠来源：牙上皮细胞包括HAT-7、SF2–24 ；小鼠：均为成釉细胞包括LS8（SW小鼠），ALC（刚出生的c57bl/6），EOE-2M及EOE-3M（出生7d的c57bl/6）； 猪来源：成釉细胞包括PABSo-E。详细内容可在这个文献中找参考文献Establishment and characterization of immortalized mouse ameloblast-like cell lines。

原代培养

实验材料：

①、小鼠：1周龄的c57bl/6小鼠

②、培养基：EpiCM+2%FBS(有文献使用的是 SMEM+10% FBS +L-glutamine+10 ng/ml recombinant human EGF，也有文献用的10%FBS的DMEM)

③、消化液：I型胶原酶（3mg/ml）

④、器械：普通镊子1支（用于夹住下颌骨），显微镊子2支，剪刀2支（一支剪下颌骨，一支于超净台中剪碎组织块）

⑤、0.2%gelatin铺板（我的明胶使用粉末配置的，粉末加入PBS后，放于55摄氏度水浴锅中几分钟使其充分溶解，之后0.22um滤器过滤）。24孔板，每孔加入200-300ul的0.2%明胶，培养箱内过夜使其成胶

方法：脱颈处死小鼠后，在75%酒精中浸泡5min，取出，紧挨着两侧口角位置，剪掉下颌骨，置于含有适量DMEM培养基（加入量以浸没剪取组织为准，培养基不加双抗也可）的大皿中，大皿置于冰上。之后在解剖显微镜下（熟练之后肉眼也能操作），显微镊子分离皮肤组织（容易剥离），可见下切牙牙冠侧被半透明组织包括，该组织即为釉上皮，镊子一侧夹住牙冠根侧，另一镊子夹住组织使其剥离，将组织浸入培养基中。组织分离完毕后移入超净台。使用含10%双抗PBS清洗2-3次，吸取组织块时将组织块吸至枪头尖端，防止组织块被吸入枪头内部难以打出。清洗完毕后转移至含少量培养基（以组织块能被浸没为准，培养基量多在剪碎组织块时组织块移动距离大，费时费力）的小皿中，剪刀剪碎组织块至1mm3大小，此时可用5ml枪头每次吸取少量组织块转移至15ml离心管中，清洗皿底残余组织块收集至离心管中。离心800rpm，3-5min,加入I型胶原酶（具体量我没仔细对比过，本人一般是5只小鼠，加入500ul胶原酶），置于37摄氏度水浴锅中1h（期间不是摇晃组织块，使其与消化液充分接触）或37摄氏度摇床1h，可见组织块呈絮状彼此粘连。使用含FBS的培养基等量加入终止消化，离心800rpm,5min，弃上清。加入1.5ml左右含2%FBS的EpiCM（我是用24孔板培养，一般5只小鼠的釉上皮可种在10个孔中，这种密度大概5-7天细胞能长满，但是不太均匀，因为是组织块培养）。充分吹打使消化后的组织块尽量分离，每孔加入约150ul左右培养基，以浸没组织块为准，宁少勿多。在第二天观察培养基的量，决定是在24h或48h后补充培养基至500ul，继续培养，期间勿动培养板，至第5-7天观察细胞生长情况。

以上均为个人经验，仅供参考。