20+的Nature子刊文章，也有逻辑漏洞？读文献学习科研思维和课题设计！实战篇7

已发表的文献千千万，并非都是完美无瑕，包括20+的Nature子刊上发表的文章，依然可能存在逻辑漏洞，今天大师兄带你一探究竟！【本文较长，可能占据5-10分钟】

今天跟大家分享一篇上周（2022.8.18）发表在Nature cancer上的关于CAF通过NUFIP1介导的核糖体自噬分泌核苷促进胰腺癌肿瘤细胞生长的研究论文，通讯作者是来北京大学基础医学院的的赵颖教授。

摘要

肿瘤相关纤维细胞CAF是胰腺癌肿瘤微环境中的主要组分。本研究发现CAF对于谷氨酰胺（Gln）缺乏条件下胰腺癌肿瘤细胞的生存维持至关重要。机制上，本研究揭示，Gln缺乏时，激活CAF发生NUFIP1介导的核糖体自噬，促进胰腺癌细胞中MYC表达，增强葡萄糖代谢相关基因表达，进而对葡萄糖摄取及利用，促进肿瘤细胞增殖。利用CAF条件性敲除小鼠模型，进行胰腺癌原位成瘤实验，证实了，靶向NUFIP1可以抑制肿瘤生长。本研究创新性的揭示了CAF中核糖体自噬通过核苷影响肿瘤细胞糖代谢这一调控网络。

研究背景

• CAF是胰腺癌肿瘤微环境中主要成分，CAF的细胞来源多种多样。                
•  之前研究发现自噬主要是非选择性自噬，最近研究发现也存在选择性自噬。选择性自噬是指，特定细胞器（主要包括核糖体、线粒体、内质网等）通过其表面特异性受体结合自噬相关蛋白ATG11，启动自噬过程，诱导特定细胞器发生自噬。

非选择自噬模式：

选择性自噬模式：

• 本研究涉及的是CAF的核糖体选择性自噬。2018年一篇SCIENCE发现，核糖体选择性自噬ribophagy由NUFIP1介导，结果是降解核糖体RNA，产生大量核苷。

• 另外，相当多的研究证实，CAF非选择性自噬可以通过分泌细胞因子、代谢物等多种途径促进肿瘤增殖、转移、干性等恶性表型。然而CAF中是否有哪种选择性自噬在肿瘤中发挥作用尚未可知，这也是该研究主要的创新性切入点。

研究结果

1.谷氨酰胺缺乏下，CAF通过NUFIP1介导的核糖体自噬促进胰腺癌增殖

Gln（谷氨酰胺）和Glu（葡萄糖）是肿瘤细胞增殖的主要碳源，然而本研究检测胰腺癌原位瘤组织微环境中Gln（谷氨酰胺）和Glu（葡萄糖）含量，发现肿瘤微环境中Gln和Glu都有显著下调，处于Gln缺乏状态。为了探究Gln缺乏状态对胰腺癌细胞增殖影响，本研究进行了体外和体内两部分实验。体外通过Gln剥夺和Gln抑制剂（968）证实，Gln缺乏可以显著抑制胰腺癌肿瘤细胞增殖能力。然而，体内通过968抑制谷氨酰胺代谢，对胰腺癌肿瘤增殖无影响。体外、体内这种结果差异提示，肿瘤微环境中存在某种中介，导致肿瘤细胞对体内Gln缺乏情况下的耐受。

而胰腺癌肿瘤微环境中，CAF是最主要的组分，因此，首先考虑CAF是否介导了Gln缺乏情况下，促进肿瘤细胞增殖？已有研究证实CAF中的自噬，可以促进肿瘤细胞增殖等恶性表型，此处如果还是以CAF自噬对胰腺癌肿瘤细胞的促增殖表型作为研究切入点，便缺乏创新性。考虑到最进研究发现，细胞可以发生选择性自噬（主要包括核糖体、内质网、线粒体），因此，本研究以此作为切入点，从更细化的选择性自噬作为创新性切入点，筛选CAF通过哪种选择性自噬促进肿瘤细胞对Gln缺乏的耐受。为此，本研究构建了针对非选择性自噬分子ATG3/5、核糖体选择性自噬分子NUFIP1、内质网选择性自噬分子Sec24c、线粒体选择性自噬受体Parkin的敲除CAF细胞株，然后利用Gln缺乏培养基培养这些CAF，再用这些CAF条件培养基CM处理Gln缺乏的胰腺癌细胞。结果发现，正常CAF条件培养基确实可以促进胰腺癌细胞在Gln缺乏下的增殖，阻断CAF非特异性自噬后，则CM不能促进肿瘤细胞在Gln缺乏下的增殖，这与之前研究结果一致，作为阳性对照。同时发现，只有特异性阻断CAF中NUFIP1介导的核糖体自噬，才能阻断CAF CM对肿瘤细胞的促增殖作用。以上结果表明，在Gln缺乏下，CAF通过NUFIP1介导的核糖体自噬促进肿瘤细胞增殖。

2.谷氨酰胺缺乏下，CAF通过核糖体自噬促进rRNA降解

接下来问题是，Gln缺乏下，CAF如何通过核糖体自噬促进肿瘤细胞增殖？

文献已经报道，核糖体自噬可以通过降解核糖体RNA，促进生成大量核苷。所以提出猜想，Gln缺乏通过诱导CAF核糖体自噬，促进核糖体RNA降解，产生核苷促进胰腺癌细胞增殖。

为证实此猜想，首先要证明Gln缺乏通过诱导CAF核糖体自噬导致核糖体RNA（rRNA）降解？实验结果表明，Gln缺乏下，CAF可以通过核糖体自噬促进rRNA降解，而不影响核糖体蛋白降解。

3.谷氨酰胺缺乏下，CAF通过核糖体自噬促进rRNA降解生成核苷促进胰腺癌细胞增殖

接着继续证实猜想：Gln缺乏通过诱导CAF核糖体自噬，促进核糖体RNA降解，产生核苷促进胰腺癌细胞增殖。

为此需要证实以下三点：

1.Gln缺乏时，CAF核糖体自噬可以产生、分泌核苷；

2.CAF来源的核苷可以被肿瘤细胞摄取；

3.核苷被肿瘤细胞摄取后可以促进肿瘤细胞增殖。

于是，该研究开展了三方面实验，分别进行了证实。

4.Gln缺乏下，CAF通过核糖体自噬分泌核苷促进肿瘤细胞代谢进而促进增殖。

接着，需要继续探究CAF来源核苷，进入肿瘤细胞中如何被肿瘤细胞代谢，进而促增殖？

为此，本研究检测了摄取核苷后肿瘤细胞内代谢改变，发现肿瘤细胞内核苷水平明显增加，且参与葡萄糖代谢的产物，包括葡萄糖都有显著增加，并且可以显著增强肿瘤细胞有氧氧化过程。

那么核苷是否直接作为碳源被肿瘤细胞利用，促进了糖代谢呢？

为此，进行了C13标记核苷同位素示踪，进行质谱检测代谢流，结果表明核苷进入肿瘤细胞后，并未参与肿瘤细胞的TCA循环，说明核苷被肿瘤细胞摄取后并不是作为直接碳源，促进肿瘤细胞糖代谢的。

5.腺苷直接促进胰腺癌细胞对葡萄糖的摄取利用

接着，既然腺苷被肿瘤细胞摄取后不能作为直接碳源参与TCA循环，那如何增强肿瘤细胞糖代谢的？

调控糖代谢分为两种层面：1.代谢物水平；2.代谢调控基因表达。

既然核苷不直接作为碳源参与肿瘤细胞糖代谢调控，考虑其最可能通过调控糖代谢基因表达进而增强肿瘤糖代谢。

为此，本研究检测了CAF来源核苷处理肿瘤细胞后，对糖代谢相关基因表达影响，发现可以显著上调糖代谢相关基因，包括葡萄糖转运体SLC2A1。同时，上部分结果观察到，核苷进入肿瘤细胞后可以增强细胞中葡萄糖水平。因而，提出以下假设：核苷进入肿瘤细胞后，通过上调肿瘤细胞糖代谢相关基因SLCA1，增强肿瘤细胞对葡萄糖摄取，进而增强糖代谢，促进增殖。

为了进一步证实以上假设，本研究继续利用C13标记葡萄糖，检测在Gln缺乏下，核苷处理肿瘤细胞后，对肿瘤细胞糖代谢影响，发现核苷确实可以显著增强肿瘤细胞糖代谢过程。

接着为了证实以上假设，进行了rescue实验，通过敲降肿瘤细胞SLC2A1或减少葡萄糖供给，阻断肿瘤细胞对葡萄糖的摄取，结果发现，CAF来源的腺苷就不能发挥促进肿瘤细胞增殖效应（在Gln缺乏条件下）。

通过以上结果证实，Gln缺乏条件下，CAF通过核糖体自噬分泌核苷，被肿瘤细胞摄取后通过上调肿瘤细胞葡萄糖转运体SLCA1，促进葡萄糖摄取，促进增殖。

6.CAF来源核苷通过激活肿瘤细胞MYC表达调控糖代谢基因

接着问题是，CAF来源核苷被肿瘤细胞摄取后，如何上调糖代谢相关基因？

为此，本研究将核苷处理前后的肿瘤细胞（Gln缺乏条件下）进行转录组测序，结果表明核苷被肿瘤细胞摄取后可以显著增MYC基因集表达，而MYC作为糖代谢调控的核心基因。因此可提出假设：CAF来源核苷通过激活肿瘤细胞MYC表达促进糖代谢基因转录。

通过实验证实，阻断肿瘤细胞核苷摄入，可以抑制MYC水平，糖代谢基因表达，同时抑制肿瘤细胞增殖。

而敲降MYC，也可以阻断核苷对肿瘤糖代谢基因的调控、糖代谢产物。

以上结果证实CAF来源核苷进入肿瘤细胞，通过激活MYC，促进糖代谢基因转录，增强糖代谢过程，促进了肿瘤增殖。

接下来问题是，核苷进入肿瘤细胞，如何激活MYC表达？

据文献报道，核苷可以通过结合基因3'-UTR，促进翻译，增强表达。本研究因此提出假设，核苷进入肿瘤细胞后，通过结合MYC3'-UT，促进其翻译，增加表达。并通过以下体外实验实验证实了这一猜测。

7.体内NUFIP1在PDAC中的作用

基于以上发现，本研究利用Gln抑制剂联合自噬抑制剂，发现可以显著抑制胰腺癌肿瘤生长。并且利用CAF中特异性敲除NUFIP1基因，阻断CAF特异性核糖体自噬，构建胰腺癌原位瘤模型，发现可以显著抑制胰腺癌肿瘤细胞增殖。

全文小结

至此，本研究的表型及机制部分证明完成。提出并证实Gln缺乏条件下，CAF激活NUFIP1以来的核糖体自噬，促进核糖体RNA降解，产生大量核苷分泌到微环境，被肿瘤细胞摄取后，结合到肿瘤细胞MYC mRNA的3'-UTR，促进MYC翻译，并通过MYC上调葡萄糖代谢相关基因促进肿瘤细胞对葡萄糖摄取及代谢过程，最终促进肿瘤细胞增殖。work model（Gln缺乏--CAF--NUFIP1介导ribophagy--核苷--PDAC myc--G代谢基--G代谢--PDAC增殖）

本研究存在问题

总体上，本研究看起来逻辑紧密，层层推进。然而还是存在一点矛盾如下：

本研究提出Gln缺乏条件下，CAF通过核糖体自噬分泌核苷，促进肿瘤细胞增加对葡萄糖摄取，促进糖代谢，进而促进肿瘤细胞增殖的调控机制。基于此，本研究也发现，在低糖条件下（5mM），CAF来源的核苷并不能促进肿瘤细胞增殖（图f-g）。然而，本研究最初发现胰腺癌肿瘤微环境是低糖条件（葡萄糖3mM）（图a），这意味着，在胰腺癌微环境中CAF并不能通过分泌核苷，促进肿瘤细胞葡萄糖摄取进而促进肿瘤增殖。因此，本研究提出的work model并不能解释最初提出的胰腺癌Gln缺乏环境下，CAF通过分泌核苷促进肿瘤生长的研究假设。这是本研究的最大矛盾点，也是最大的不足之处！

孟子曰：尽信书，则不如无书。

我们针对文献学习不能盲目，应该带着批判的眼光，取其精华，选择性吸收。

希望对大家文献学习和课题逻辑设计有些启发~