Nat Commun（Q1，17.694） | PUMILIO 蛋白通过抑制 p21 促进结直肠癌的生长

文章题目：PUMILIO proteins promote colorectal cancer growth via suppressing p21

发表期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

发表时间：2022年

合作单位：上海高级免疫化学研究所

样品类型：Male or female BALB/c nude mice，HCT116, RKO, COLO205, LOVO, SW480, SW620, HT29 cells，Colon normal immortalized epithelial cell line NCM460

运用技术：细胞周期，细胞凋亡，细胞生长曲线，细胞克隆，Q-PCR，WB，RIP，RNA-seq，TMT，PAR-CLIP

研究背景

结直肠癌（CRC）占所有癌症的10%，排名第三，死亡率排名第二。尽管APC、TP53、KRAS等基因改变和 Wnt、RAS-MAPK 和 PI3K 等关键信号通路在驱动 CRC 中的作用已被广泛研究，CRC的发病率和死亡率仍处于各类癌症的前列，并且一直呈上升趋势。最近的研究表明，RNA 结合蛋白似乎对 CRC 的起始和发展很重要。然而，这些蛋白质在 CRC 中的确切作用以及它们如何调节 CRC 中的 RNA 靶标仍然很大程度上未知。

PUMILIO (PUM) 蛋白属于高度保守的 PUF (Pumilio-Fem3 结合因子) 家族的 RNA 结合蛋白。在大多数情况下，PUM 蛋白与靶 mRNA 的 3'UTR 结合并募集伴侣蛋白以降低 mRNA 的稳定性和/或抑制其翻译。许多 PUF 靶基因因其在胚胎发育、体轴形成、体型控制、神经发生、精子发生和干细胞的自我更新。此外，PUM 蛋白最近已成为癌症中很有前途的调节剂。

重要结果

此研究报告了人类 PUM1 和 PUM2 在 CRC 肿瘤发生中的重要功能。对来自 22 名患者及其邻近组织的人类 CRC 样本中的 mRNA 表达进行了成对比较，发现15个肿瘤组织中的Pum1的表达量，13个肿瘤患者中的Pum2的表达量比其癌旁组织至少高表达10倍以上，TCGA 数据集显示 Pum1 而不是 Pum2 表达与 CRC 阶段呈正相关，证明了该功能部分是通过抑制负细胞周期调节因子 p21 的表达来实现的。此外，作者表明静脉注射包裹有抗Pum1和Pum2 siRNA 的纳米颗粒可显着抑制小鼠中人结直肠肿瘤的生长。这些发现定义了 PUM 蛋白在 CRC 中的生物学功能及其潜在的分子机制，为CRC的治疗提供了新的途径。

图 1：Pum1/2 CKO抑制结直肠癌的发展。

在本文中报道了人类 PUF 蛋白家族的两个成员 PUM1 和 PUM2 对 CRC 的起始和进展的需求。此外，作者发现这种促进癌细胞生长的功能部分是通过抑制细胞周期负调节因子p21的表达来实现的。最后，作者表明通过静脉注射纳米颗粒包装的抗 PUM siRNA 治疗 CRC 模型有效地减少了肿瘤的生长。这些发现提供了对CRC肿瘤发生重要的新分子机制以及治疗CRC的潜在新方法的见解。

图 2：PUM1 和 PUM2 驱动结直肠癌细胞体外生长和体内致瘤性。

近年来，多项研究报道人类PUM蛋白发挥重要的致癌作用。但PUM蛋白在不同肿瘤中的功能不同，PUM蛋白究竟是致癌基因还是抑癌基因，一直存在争议。据报道，PUM1 和经典的致癌 miRNAs miR-221 和 miR-222 共同抑制人乳腺癌细胞和 HEK293 细胞中细胞周期抑制蛋白 p27 的表达。由于 PUM1 的敲低减少了 S 期细胞的数量并抑制了细胞增殖，作者提出 PUM1 可能促进乳腺癌的肿瘤发生。在非小细胞肺癌中，肿瘤抑制因子 miR-340 直接与Pum1和Pum2的 3'UTR 结合mRNA 来抑制它们的表达，从而减少 miR-221/222 与p27 3'UTR相互作用所需的 PUM1 和 PUM2 。此外，最近在白血病细胞中的研究表明，PUM 蛋白可以直接与转录因子 FOXP1 的 mRNA 结合，从而提高 FOXP1 蛋白的表达水平，从而增加造血干细胞和髓性白血病细胞的增殖。此外，PUM1 和 PUM2 通过去腺苷酸化抑制激酶激活剂 GC-32，从而促进 EB 病毒永生化 B 细胞的生长。最后，PUM1 可以促进卵巢癌的发展. 所有这些研究都与作者的发现相似，即敲除或敲除 PUM1 和 PUM2 通过上调 p21 表达来阻断细胞 G1/S 相变（图 2和5），从而显着抑制 CRC 细胞的增殖。以上所有研究都揭示了肿瘤发生需要PUM蛋白。

图 3：癌症相关基因在受Pum1 -/- HCT116 细胞影响的基因中富集。

然而，迈尔斯等人发现PUM1和PUM2共同抑制膀胱癌中癌基因E2F3与miRNA的表达。在这种类型的癌症中，尽管 PUM1 或 PUM2 蛋白本身的水平没有显着变化，但与 PUM 蛋白协同作用的 miRNAs（miR-503、miR125b）的水平显着降低，这使得肿瘤发生成为可能。在三阴性乳腺癌细胞中，致癌基因c-jun的 3'UTR 中的 PRE因选择性多聚腺苷酸化而被删除，这会促进癌症。这些研究表明 PUM 蛋白具有抑癌作用。因此，PUM 蛋白在不同的癌症中具有相反的功能。这种差异可能是由于它们靶向不同的基因或与不同类型癌症中的不同蛋白质结合。

该研究的一个重要发现是p21 mRNA 是 PUM1 的直接和主要靶标。为了获得更可信的 PUM1 目标 mRNA，作者在 CLIP 数据分析中使用了相对严格的标准，包括对 PARalyzer 的参数调整、两个生物复制的结合位点交叉以及假定的背景信号去除。这导致 160 个 PUM1 结合的目标 mRNA。当作者降低严格性时，从 CLIP 中恢复了更直接的靶基因，包括与Pum1中显示差异表达的 mRNA 或蛋白质的基因重叠的靶标数量增加-/-细胞。作者将自己限制在 160 个目标，以避免误报目标。令作者惊讶的是，在超过 1000 个表达被Pum1 -/-细胞改变的基因中，只有 15 个和 48 个被 PUM1 结合。这表明大多数差异表达的基因是 PUM1 的间接靶标。同时，PUM1 可能与一些没有任何显着调节功能的 mRNA 结合。此外，由于 PUM1 和 PUM2 与重叠的一组目标结合，因此 PUM1 和 PUM2 的结合可能需要对 160 个 PUM1 目标 mRNA 中的其他一些产生易于检测的监管努力。最后，PUM1 可能会与一些没有任何显着调节功能的 mRNA 结合。

在 160 个靶标中，p21是直接 PUM1 靶基因中唯一与细胞周期相关的基因，这些基因在 mRNA 和蛋白质水平均受 PUM1 调节（图 5）。先前的一项研究报道，PUM1 和 PUM2 正向调节 FOXP1，并且 FOXP1 通过抑制人类造血干细胞/祖细胞和白血病细胞中p21的表达来介导 PUM 蛋白的生长促进活性。他们的结果表明 PUM1 负调节p21，这与作者的发现一致。然而，作者提供了强有力的证据表明 PUM1 通过 p21 的 3'UTR PRE 直接结合并抑制p21mRNA 不是通过 FOXP1 或其他因素。作者的研究结果表明，PUM1通过促进p21 mRNA 转换显着下调p21的 mRNA 和蛋白质水平，可能是通过众所周知的途径，其中 PUM 蛋白与 CCR4-POP2-NOT 脱腺苷酶复合物相互作用以抑制 mRNA 稳定性。这最终导致 CRC 增殖和 G1/S 转换缩短。

图 4：PUM1 目标的 PAR-CLIP-seq 识别。

基于作者的结果，作者提出了以下模型来说明 PUM 蛋白在人类 CRC 中的功能：PUM1 在 CRC 中高度表达并与p21 mRNA 结合以降低其表达。这减轻了 p21 对细胞周期和细胞生长机制的抑制，从而使 CRC 进展。Pum1缺失或p21 RPE 突变消除了 p21 的 PUM 抑制，从而导致 CRC 生长缺陷和 G1/S 过渡延迟。

PUM 蛋白在许多组织中广泛表达，因此为了评估 PUM 蛋白是否可以用作癌症治疗的靶标，需要确定这种治疗是否会引起广泛的副作用。值得注意的是，小肠上皮细胞中的Pum1；Pum2双敲除对作者的小鼠 CRC 模型中的肠道稳态和功能没有任何可检测的影响。相反，作者发现条件性敲除Pum1和Pum2有效地阻止了结直肠肿瘤的发生和发展（图 1e-i）。也许最重要的是，当作者通过尾静脉注射包裹有抗Pum1/2 siRNA 的纳米粒子来治疗结肠原位植入肿瘤时，这些 siRNA 阻止了结直肠肿瘤的进一步生长，而对其他器官没有明显影响（图 6g）。这可能是因为 PUM 蛋白在 CRC 中的表达水平高于正常组织，因此对Pum敲低更敏感和/或因为纳米颗粒在这些肿瘤细胞中高度积累。作者的结果表明使用 PUM 蛋白作为 CRC 治疗靶点的可行性。系统检查Pum1/2 siRNA 负载纳米粒子的生物分布，以及 Pum1 的水平未来在其他组织中的 Pum2和Pum2将进一步检验这种可行性。

原文总结

Pum1 和 Pum2 在人类结直肠癌 (CRC) 中的表达增加。 小鼠肠道特异性敲除 Pum1 和 Pum2 显着抑制 AOM/DSS 模型中结肠炎相关癌症的进展。 人类 CRC 细胞中 Pum1 和/或 Pum2 的敲除或敲除导致致瘤性显著降低和 G1/S 转换延迟。 作者将 p21/Cdkn1a 确定为 PUM1 的直接目标。p21 mRNA 中 PUM1 结合位点的消除也导致癌细胞生长减少和 G1/S 转换延迟。 此外，在小鼠原位结肠癌模型中，静脉注射纳米颗粒封装的抗 Pum1 和 Pum2 siRNA 可减少结肠直肠肿瘤的生长。 这些发现揭示了 PUM 蛋白对 CRC 进展的需求及其作为治疗靶点的潜力。