求助！救救孩子~WB曝光后是空白条带

各位老师好，下面简单介绍我的实验步骤。

我要的目的蛋白分子量是在12kDa，用的雅酶12.5% 快速凝胶试剂盒。

普通电泳，先80V，跑过上层胶后换120v，整个时长大概1.5h。

转膜，湿转法，200ma，60min(内参在42，就一起转了)

牛奶封闭2h~2.5h 4℃

一抗4℃敷育20h左右 (ps:学校大停电，一抗孵育了两天，也是木有条带)

然后二抗孵育2h

中间用tbst洗的话我没有洗的很严格，看心情洗的

最后曝光内参有的，也很齐

目的条带啥也木有，如图所示

我现在怀疑是不是转膜时间过长，转丢了呀，要么就是抗体不行，我也做阳性对照了，还是木有我对WB实验一点信心都木有了

请各位老师帮我出出主意谢谢！