快报｜免疫信息学分析结核分枝杆菌潜伏感染诊断和预防的肽基的生物标志物

作者：程鹏，王亮，龚文平

第一作者及单位：程鹏，解放军总医院第八医学中心结核部，北京市结核病诊疗新技术重点实验室/结核病防治重点实验室；河北北方学院

通信作者及单位：龚文平，解放军总医院第八医学中心结核部，北京市结核病诊疗新技术重点实验室/结核病防治重点实验室；王亮，解放军总医院第八医学中心，老年医学科

In silico Analysis of Peptide-Based Biomarkers for the Diagnosis and Prevention of Latent Tuberculosis Infection

Peng Cheng，Liang Wang，Wenping Gong.

Front Microbiol，2022 ,13: 947852. 

doi: 10.3389/fmicb.2022.947852

研究背景

  结核病（TB）是一种感染结核分枝杆菌（MTB）引起的呼吸道传染性疾病，已成为仅次于COVID-19引起的死亡人数最多的传染病。研究调查发现，全球约有23%的人群感染了MTB，但发病的只有10%，这意味着接近90%的人都是LTBI。目前对LTBI和ATB的鉴别还没有特异性的诊断方法，只有结核菌素皮肤试验（TST）和IFN-γ释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）通过了WHO的认可被用作LTBI的辅助诊断。传统的TST以PPD为抗原刺激物，尽管该方法具有价格低廉、简便易行、无需特殊设备等优点，但是其无法排除BCG接种带来的干扰，对BCG普遍接种国家的检测造成了挑战。近年来一些新的检测方法被开发出来，比如新型的TST方法有Diaskintest、C-Tb skin test和EC-Test，新型的IGRA方法有T-SPOT.TB、QFT-GIT、QFT-Plus、LIAISON QFT-Plus以及LIOFeron TB/LTBI等。这些新技术不约而同地用EAST-6和CFP10抗原替换了传统TST的PPD抗原。这两种抗原分别是由Rv3874和Rv3875基因编码，可以排除BCG接种对LTBI的诊断干扰，降低了诊断的假阳性率，但他们均不属于结核分枝杆菌潜伏期表达的抗原，所以仍无法将LTBI人群从ATB患者中鉴别开来。因此，我们迫切需要研发一种特异性诊断LTBI的方法，实现对LTBI人群的精准诊断和早期干预。

研究方法

    1、抗原多肽的预测

   选择出Rv1737c (narK2)、Rv2659c、Rv2660c、Rv1981c (nrdF1) 和 Rv3879c (espK)5个最有鉴别潜力的LTBI-RD相关抗原。使用IEDB的 MHCⅡ server（http://tools.iedb.org/mhcii/）、VaxiJen v2.0 server（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）、IFN epitope server（http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/index.php）筛选出最终的HTL表位。使用IEDB MHC Ⅰ server（http://tools.iedb.org/mhci/）、Class I Immunogenicityserver （http://tools.iedb.org/immunogenicity/）、VaxiJen v2.0 server（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）筛选出最终的CTL表位。使用ABCpred server（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）筛选出最终的B细胞表位。

   2、多肽分子免疫原性、抗原性和理化性质等特征的预测

   使用IEDB Immunogenicity server (http://tools.iedb.org/immunogenicity/)预测多肽分子的免疫原性；VaxiJen v2.0 (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)和ANTIGENpro server(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)预测多肽分子的抗原性；AllerTOP v.2.0server (http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/)和Allergen FP v.1.0 server (http://ddg-pharmfac.net/AllergenFP/)预测多肽分子的致敏性；Toxin Pred server (http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)预测多肽分子的毒性。最后使用Expasy Protparam server (https://web.expasy.org/protparam/)预测多肽分子的理化性质，Protein–Sol server (https://protein-sol.manchester.ac.uk/)预测多肽分子的溶解性。

   3、多肽分子二、三级级结构的预测及与toll样受体亲和力的预测

   使用PSIPRED server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测多肽分子的二级结构。使用I-Tasser server (https://zhanggroup.org//I-TASSER/)预测多肽分子的三级结构，并使用GalaxyRefine web server (https://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE)进行优化。随后使用ProSA-web server (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)、ERRAT server (https://saves.mbi.ucla.edu/)、SWISS-MODEL server (https://swissmodel.expasy.org/assess)对三级结构进行验证。最后使用ClusPro2.0server (https://cluspro.bu.edu/home.php)对TLR2、TLR4进行配体-受体的对接分析。

    4、多肽分子一次免疫注射模拟的预测和表达优化

   使用C-immsim在线服务器（https://150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php）预测多肽分子诱导免疫细胞产生特异性抗体和各种细胞因子的能力。使用Snapgene软件对多肽分子进行表达优化。

研究结果

   1、HTL、CTL和B细胞表位的筛选和预测

   最终我们选择了4个HTL表位，5个CTL表位和3个B细胞表位，表位预测结果见下表，并将其命名为C543P。HTL表位之间的连接选择GPGPG连接子，CTL表位之间的连接选择AAY连接子，B细胞表位之间的连接选择KK连接子，最终构成了我们的多肽分子，结构图见下图。

    2、C543P分子免疫原性、抗原性和理化性质等特征

    3、多肽分子二、三级级结构的预测及与toll样受体亲和力

   C543P分子中α螺旋占43.6%，β折叠占15.8%，无规则卷曲占40.6%。使用I-TASSER server预测了C543P分子的三级结构模型，其中最好的模型C-score 是-2.36。随后使用Galaxy WEB server对该模型进行了优化，C543P模型GDT-HA值为0.9469，RMSD值为0.429，MolProbity值为2.13，Clush score为10.7, Poor Rotamers为0.7，Rama favored为88.8，见图1。

图1：A是I-Tssser服务器上获得的C543P多肽分子的3D模型，B是由Galaxy refining服务器优化后的抗原分子3D模型，彩色结构添加在灰色的粗略模型上

   ProSA在线工具预测优化后C543P分子的Z-score为-7.9（图A），能量图见图B。C543P分子通过ERRAT服务器优化后其Overall Quality Factor从86.9436%提升到91%。Ramachandran图显示，优化前C543P分子Favored region为75.39%，outliers region为7.85%，rotamer region为9.70%（图C），优化后Favored region为88.77%，outliers region为1.92%，rotamer region为0.37%（图D），C543P分子的Favored region从75.39%提升到了88.77%。使用ClusPro2.0server 将C543P分子与TLR2和TLR4受体进行分子对接，服务器分别生成了30个预测的复合体，最终C543P分子与TLR2受体和TLR4受体所需结合能量分别是是-1091.7 kcal/mol和-1102.7 kcal/mol。

    4、多肽分子一次免疫注射模拟的预测和表达优化

   使用C-immsim server 进行免疫模拟时发现，C543P能够有效刺激固有免疫系统产生免疫应答。结果显示，NK细胞数目呈阶段波动性的上升，在第9天时达到高峰（图A）。DC细胞数目在第23天时达到最高峰，主要以resting DC细胞为主，其中Presenting 2 DC cells数目在C543P刺激后第2天就达到峰值，随后逐渐下降（图B)。研究结果显示，C543P分子刺激后Presenting 2巨噬细胞开始增殖，在第2天达到峰值，随后逐渐下降(图C)。当Presenting 2巨噬细胞达到最高峰时，活跃的巨噬细胞随即开始加速增殖，并在第7天时达到峰值并持续保持高水平激活状态(图C)。此外，上皮细胞在受到C543P刺激后会产生显著高水平的免疫应答且一直维持在一个较高的水平（图D）。

   结核分枝杆菌的清除和杀灭主要依赖于适应性免疫反应。模拟结果显示，C543P分子刺激机体后B淋巴细胞在初期主要执行抗原提呈功能，Presenting 2 B淋巴细胞数目在C543P刺激后第2天达到450 cells/立方毫米，随后active B淋巴细胞大量增殖，在C543P刺激后第7天时达到峰值（图A）。C543P可诱导B淋巴细胞产生高水平的IgG和IgM抗体，在第六天达到峰值（图B）。CD4+T淋巴细胞是杀灭和清除结核分枝杆菌的主要效应细胞。结果表明，C543P能够刺激记忆性和非记忆性CD4+T淋巴细胞显著增殖，在第10天达到峰值（>3500 cells/立方毫米），随后缓慢下降（图C）。活跃期和休眠期的辅助T淋巴细胞在第7天时达到高峰，之后开始缓慢下降（图D）。调节性T细胞可以调节辅助性T细胞的免疫反应，避免Th1和Th2型细胞免疫反应过激。预测数据显示，调节性 T 细胞在C543P刺激后的第5天达到了峰值140 cells/立方毫米，随后逐渐减少（图E）。据报道，细胞毒性T淋巴细胞通过产生颗粒酶和一氧化氮杀死被结核分枝杆菌感染的细胞。因此，我们发现非记忆性细胞毒性T细胞的数量逐渐增加并在第13天达到峰值（1150 cells/立方毫米），而记忆性细胞毒性T细胞的数量保持在 1125 cells/立方毫米的水平（图F)。除此之外我们还发现，细胞毒性T淋巴细胞数量逐渐增加，并在刺激后第30天达到峰值，而resting细胞毒性T淋巴细胞数量则呈现相反的趋势（图G）。我们的结果还显示，C543P可以诱导显著高水平的 IFN-γ 和 IL-2等细胞因子（图H）。 

研究结论

   我们利用免疫信息学工具设计了一种既可以用于诊断LTBI人群的新型多肽分子C543P，该分子具有较高的抗原性和免疫原性，同时是非致敏性和非毒性的。C543P分子与TLR2和TLR4均具有较好的亲和力，且能够诱导人体产生高水平的固有免疫和适应性免疫应答，并以显著高水平的Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2为特征。本研究为结核分枝杆菌潜伏感染的诊断和预防提供了一种潜在的候选诊断抗原和疫苗分子。

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