5 步带你用 GEO2R 写出第一篇生信文章！

各种编程软件让很多科研人对生信文章望而却步，但其实用 GEOR2 分析工具就足以写出一篇生信了！火山图、平均差图、 UMAP 图、韦恩图、表达密度图、P 值直方图、样本分位数图、平均方差趋势图...用这个都能做！

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一、序列号检索

首先，进入 GEO 数据库官网：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

在 GEO 数据库检索框内输入你想要进行分析的芯片序列号，当然这里也可以直接按照关键词的方式来检索。我们以「GSE79973」为例，点击「Search」。如果这个芯片与多个平台相关联，那么就选择感兴趣的平台。

图片来源：网站截图

二、GEO2R 分析

在结果页面下拉，点击「Analyze with GEO2R」进行分析。这里大家要注意，GEO2R 主要是对芯片数据（array）进行分析，但不是所有系列数据都能用 GEO2R 工具进行分析。

比如，测序数据就不可以进行 GEO2R 分析，因此，在检索结果页面不会显示「Analyze with GEO2R」按钮。

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三、设置分组

在「Samples」表格中，单击「Define groups」进行分组，输入要比较的样品组的名称，例如，「test」和「control」。

最多可以定义 10 个组。为了保证分析能够正常进行，必须至少定义两个组别。点击组名右侧的叉图标可以删除该组。对于 2 组比较，通常首先定义对照组，然后定义测试组。

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四、样品分配

用鼠标单击样品栏突出显示相关的样本行，或使用「Ctrl」或「Shift」键，可以突出显示多行。之后，单击组名称以将那些样本分配给该组。其他组同样重复上述步骤。

注意：并不需要选择系列中的所有样品才能进行分析。本次我们以每组选择 4 个为例。

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五、执行分析

将样品分配到组后，单击表格下方「Analyze」按钮以默认参数运行分析。或者，我们可以在「Options」中编辑默认分析参数。

例如，我们可以设置其他 P 值等。我们可以在不分配组别的情况下单击「分析」按钮，并检索得 UMAP，箱线图，表达式密度和平均方差趋势图。

这些图可以帮助您评估标准化状态和样本分组，也就是说，它们可以帮助我们确定研究是否适合进行进一步分析，以及是否对测试进行任何调整。

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分析结果图形图表相结合，不仅以帮助可视化差异表达的基因还可以快速评估数据集质量。

1. 显著差异基因列表

结果显示为按 P 值排名的前 250 个基因的表格。P 值越小基因差异性越显著。单击其中某一行，可以显示该基因的基因表达谱图。

图形中的每个红色条形表示原始数据中该基因的表达量。图表底部还列出了样品的编号和组名。

如果想要查看包括排名前 250 个基因的所有差异基因以及基因的更多信息，可以点击「Download full table」链接下载完整数据表格，下载的表格可以在 Excel 中打开。

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2. 火山图

图中每一个点代表一个基因，由 limma（volcanoplot）算法生成，火山图可以显示统计显著性（-log10 P 值）与变化幅度（log2 倍变化）的对比，可用于可视化差异表达的基因。

单击「Explore and download」链接可以下载高清原始图片。有颜色的点代表差异表达显著的基因，（红色 = 上调，蓝色 = 下调）。

我们可以在「Options」选项中设置火山图显示单个对比的测试结果（对比是一个样品组与另一个样品组的对比）。

因此，如果我们在分析中定义了两个以上的样品组，则会为每个对比组生成一个单独的图。

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3. 平均差图

使用 limma（plotMD）包生成的平均差（MD）图可以显示 log2 倍数变化与平均 log2 表达值之间的关系，用于可视化差异表达的基因。类似于火山图，有颜色标记的基因表示显著差异表达（红色 = 上调，蓝色 = 下调）。

我们同样可以在「Options」中更改 P 值的设定。使用下载重要基因按钮可下载每种对比中突出显示的基因。

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4. UMAP 图

使用 umap 生成的降维图可用于可视化样本之间的相互关系。

也可以在不选择「Samples」组的情况下生成此图，只需在定义组之前单击「Analyze」即可。这张图可以帮助判断，定义的两组样本是否整体上确实存在比较明显的差别。

比如，下图所示 test 和 control 的各自 4 例样本整体还是比较能分开，说明这两组之间在表达谱层面还是有比较明显的整体差异特征。

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5. 维恩图

使用 limma（vennDiagram）算法生成，用于研究多个组别之间重要基因的重叠关系。可以下载维恩图上每个区域的基因。

但是这部分的分析具有一定的局限性：

最多可以绘制 5 个对比数据。当定义了 > 5 个组时，默认显示最高和最低表达基因数的对比。

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6. 箱形图

使用 R boxplot 算法生成，用于查看所选样本的值分布。样品根据分组显示不同的颜色。

查看分布对确定我们选择的样本是否适合差异表达分析很有帮助。通常来说，以中位数为中心的值表示数据已标准化且可交叉比较。

如果显示未能标准化，可以考虑在「Options」中选中「Force normalization」选项进行强制规范化，从而使所有选定的 Samples 具有相同的值分布。

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7. 表达密度图

使用 R limma（plotDensities）算法生成，表达密度图可用于查看所选 Samples 值的分布。是对箱型图数据的补充，用于在差异表达分析之前检查数据归一化，样品根据不同组别会显示不同颜色。

如果每个样品的密度曲线差异很大，则可以考虑在「Options」选项卡中选中「Force normalization」强制规范化。该图显示的是对数转换和归一化后的数据。

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8. P 值直方图

使用 hist 算法生成，P 值直方图用于查看分析结果中 P 值的分布。此处的 P 值与之前最显著差异基因列表中的 P 值相同，并使用所有选定的对比度进行计算。

虽然显示的表格受大小限制（不能显示全部 250 个），但我们可以通过设置显示所有分析基因的 P 值分布来查看整图。

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9. 样本分位数图

使用 limma（qqt）算法生成，根据 t 分布的理论分位数绘制数据样本的分位数。该图有助于评估 limma 测试结果的质量。

理想情况下，这些点应沿一条直线上，这会表明在测试过程中计算出的调节 t 统计量的值遵循其理论预测的分布。

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10. 平均方差趋势图

使用 R limma（plotSA， vooma）算法生成，拟合线性模型后，平均方差趋势图可以检查表达数据的均值-方差关系。它可以帮助显示数据间是否变化过大。

当存在很强的均方差趋势时，精确权重可提高测试结果的准确性。该图不需要选择分组。每个点代表一个基因。红线是均值-方差趋势线，蓝线是固定方差近似值。

可以在不选择「Samples」组的情况下生成此图，只需在定义分组之前单击「Analyze」即可。

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