J Neuroinflamm（Q1，9.587） | Smek1通过促炎和抑制IDO1-AhR通路加剧自身免疫性脑脊

文章题目：Smek1 deficiency exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis by activating proinflammatory microglia and suppressing the IDO1-AhR pathway

发表期刊：Journal of Neuroinflammation

影响因子：9.587

发表时间：2021年

发表单位：山东大学基础医学院齐鲁医学院

样品类型：Smek1-floxed mice，Smek1^fl/+ Sox2-Cre and Smek1^fl/fl Sox2-Cre mice

运用技术：基因芯片，自身免疫性脑脊髓炎模型，免疫组化，流式细胞术，RT-PCR，单细胞转录组测序，WB

研究背景

蛋白磷酸酶4(PP4)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。MEK1的抑制子(SMEK1)是PP4酶的调节亚基，它调节PP4催化亚基的活性，通过未知机制导致其靶底物去磷酸化。PP4参与生物体内的许多细胞过程并调节多种细胞信号通路，包括核因子kappaB(NF-κB)、c-JunN末端激酶、凋亡信号、胰岛素受体底物蛋白4和雷帕霉素靶点，然而，SMEK1对免疫系统和自身免疫性疾病的影响仍不清楚。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是一种多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)的疾病模型，其特征是免疫系统和中枢神经系统(Central nervous system，CNS)的免疫功能异常导致脱髓鞘。小胶质细胞与巨噬细胞和星形胶质细胞一起，是大脑和脊髓活动性MS病变中最丰富的免疫细胞。此外，小胶质细胞在MS外观正常的白质和灰质中被激活。大多数研究都集中在MS/EAE发作后促炎性小胶质细胞的生物学过程。然而，很少有研究发现在疾病发展之前已经存在的小胶质细胞异常可能导致疾病的易感性。

重要结果

     1. SMEK1减少导致EAE模型中症状加重

通过GEO数据库中MS患者外周血和脑组织的转录数据进行分析，结果显示患者的外周血单个核细胞和病变脑脑组织中SMEK1表达量降低。通过建立EAE模型后发现术后第13天出现症状，且整个实验中临床评分高于对照组小鼠。MBP染色、免疫组化染色发现EAE小鼠模型的小胶质细胞与巨噬细胞显著累积，NF-κ b通路被激活。

     2. Smek1杂合性促进小胶质细胞活化和中枢神经系统炎症

为了证实Smek1表达的杂合性促进小胶质细胞的激活，介导神经炎症，研究结果进一步发现EAE小鼠白质、皮质和脊髓中激活的小胶质细胞数量更多，脑中IL-1β mRNA表达水平升高。并对人小胶质细胞HMO6中建立了plvx-SMEK1-puro和shSMEK1细胞株分析发现IL-1β mRNA表达水平出现类似现象。

     3. Smek1缺乏导致形成一个独特的促炎小胶质簇

单细胞转录组测序分析Smek1-/-小鼠的皮质和海马样品细胞分群特异性和表达谱，共分为12个细胞亚型。总小胶质细胞（集落刺激因子1受体(Csf1r)进行标记）的表达热图表明，虽然野生型和Smek1-/-小鼠的总小胶质细胞表现出相似的表达模式，小鼠总小胶质细胞的聚类在tSNE图中确定了四个群体，大多数野生型小胶质细胞倾向于分为簇0和1，而Smek1-/-小胶质细胞簇2和3中的细胞较多，Smek1-/-簇3中观察到更高的IL-1β表达水平和IL-1β阳性细胞，

cluster 3中巨噬细胞中显示出Csf1富集。伪时间分析结果显示Smek1缺陷小胶质细胞促炎细胞因子上调，包括IL-1β。簇3标记基因的KEGG分析显示富集于与炎症途径相关通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB途径。通过研究Smek1-/+小胶质细胞中Csf1的空间和时间表达特征结果等也证实，随着Smek1功能部分或完全丧失，一种新的Csf1+小胶质细胞簇具有可能促进神经炎症的预激活表型。

     4. Smek1杂合性促进巨噬细胞活化

由于小胶质细胞起源于卵黄囊巨噬细胞，而卵黄囊巨噬细胞也可以分化为外周巨噬细胞，由于小胶质细胞来源于卵黄囊巨噬细胞，它也可以分化为外周巨噬细胞，作者推测Smek1-/+巨噬细胞参与了促神经炎症的过程。结果证实Smek1杂合子外周中F4/80+IL-1β+巨噬细胞比例和脾脏巨噬细胞IL-1β的平均荧光强度升高。为了进一步研究Smek1-/+骨髓细胞的特征，对小鼠的脾脏研磨提取RNA后进行qPCR，结果显示，LPS处理组的IL-1β水平升高，幼稚组的IL-1β水平也增加。后续实验表明，Smek1-/+巨噬细胞在“静息”状态下也被预激活，并通过过表达IL-1β促进炎症的发生。

     5. Smek1通过调节IFN-γ/STAT1轴来维持IDO1

由于髓鞘抗原特异性CD4Th细胞的激活对MS的发病机制至关重要，作者检查了CD4阳性T细胞是否参与加重Smek1-/+小鼠的EAE。与对照小鼠相比，与对照组小鼠相比，Smek1-/+小鼠脾脏和淋巴结中CD4+细胞中CD4+IFN-γ+细胞的比例大大降低。脾单核细胞的体外研究表明，在抗CD3和CD28刺激后，Smek1-/+细胞中的T-bet和IFN-γ显著降低，当用抗CD3/CD28或LPS处理时，IDO1及其转录因子p-STAT1在Smek1-/+细胞中降低，此外，IFN-γ/STAT1依赖于IDO1活性，用特异性抗体阻断IFN-γ导致两组的IDO1消融。随后通过对EAE脾脏和脑组织中的IDO1mRNA和蛋白质水平检测发现IDO1mRNA和蛋白质水平在Smek1-/+小鼠大脑和脾脏降低。

     6. IDO1-AhR信号通路的失活会破坏Smek1-/+髓系细胞的免疫抑制

研为了证实IDO1-AhR通路的下调可能会进一步干扰Smek1-/+小鼠中免疫抑制的维持，并在EAE期间引发明显的炎症，作者首先检测了AhR小胶质细胞的亚细胞定位。IDO1活性降低可能导致AhR核易位功能障碍。脊髓小胶质细胞核中AhR信号降低。这一发现在LPS处理的HMO6细胞中得到进一步证实。LPS刺激导致AhR在对照小胶质细胞中呈核或近核分布，但AhR分子分散在转染SMEK1shRNA的HMO6细胞中。AhR是已知的IL-10阳性转录因子，可调节EAE中的免疫反应。在Smek1-/+小鼠中，临床评分与IL-10水平呈负相关；检查了IFN-γ导致DC的耐受性实验也发现，在 Smek1 -/+ EAE小鼠的MHC-II在脾脏和淋巴结DCs中的平均荧光强度增加，证明Th1激活后IFN-γ分泌降低，从而抑制髓系细胞IDO1-AhR免疫抑制级联反应，与Smek1-/+ EAE小鼠临床症状恶化密切相关。

原文总结

SMEK1在维持小胶质细胞稳态方面发挥着关键作用，SMEK1在多发性硬化症患者外周血和脑组织中表达下调，Smek1通过激活EAE模型中的骨髓细胞引起更严重的症状，它通过调节吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1)-芳烃受体(AhR)途径来维持免疫抑制功能所必需的。单细胞测序和体外研究表明，Smek1缺陷型小胶质细胞和巨噬细胞在稳态下被预激活。MOG35-55免疫后，Smek1-/+小鼠的小胶质细胞和巨噬细胞在高峰期发生过度活化并过表达IL-1β，Smek1-/+EAE小鼠的干扰素γ(IFN-γ)减少引起的IDO1-AhR通路的功能障碍、抗原呈递能力增强和抗炎过程抑制所致。综上所述，SMEK1通过免疫系统和中枢神经系统中的免疫抑制和炎症调节在自身免疫性脱髓鞘发病机制中发挥保护作用，Smek1可能是开发MS早期介入治疗的一个可能靶点。