抗体纯化求助

血清跑wb时能孵出目的蛋白，但背景深；进行纯化后，就孵不出来了，看大家都说是抗体失活了，可是我在用ph2.7甘氨酸洗脱前已经预先把1/10中和液加入Ep管中，所以我的抗体到底为什么会失活呢，求大佬指导。