免疫组化染不上色

做免疫组化已有一个多月了，我做的是睾丸的石蜡切片，孵育磷酸化抗体

1、切片5mm,烘箱65度，1.5h 

2、二甲苯20min

   二甲苯20min

   无水乙醇10min

无水乙醇10min

95%乙醇5min

90%乙醇5min

80%乙醇5min

70%乙醇 5min

超纯水5min

3、抗原修复

修复液由柠檬酸，柠檬酸钠配置而成，煮沸5min,加片子；中高火3min,室温3min；中低火3min,室温3min；解冻3min；晾至室温。

4、灭活内源性过氧化物酶

工作液由过氧化氢和Triton配置而成，孵育15min,洗3遍，每遍2min。

5、封闭

5%BSA，10min

6、一抗 过夜，12h

7、二抗 45min

8、显色复染

9、脱水透明封片

现有问题：DAB显色组织未变棕黄，我的条件步骤都和之前一样，以前都没问题，现在已经连续三次染不出来了，目前已经排除了二抗，DAB的问题，一抗和过氧化氢，Triton都是新配的

救救孩子，很急