Keap1-Nrf2-ARE信号通路

Keap1-Nrf2-ARE信号通路

一、Keap1-Nrf2-ARE信号通路

生理状态下，Keap1可通过泛素化降解 Nrf2。而当 ROS 产生和清除的平衡被破坏时，Keap1 会失活，导致 Nrf2 清除受阻，最终导致 Nrf2 的过度积累和激活。然后 Nrf2 转位到细胞核中，以 ARE 为靶点，调节抗氧化应激相关基因的表达[1]。

1、Keap1

（1）Keap1结构

Kelch 样 ECH（epichlorohydrin，环氧丙氯烷） 关联蛋白-1（Kelch-like ECH associated protein-1，Keap1）是 Kelch 家族的一种多区域阻遏蛋白，相对分子质量为 6.9×10^4。Keap1 主要存在于细胞质中，是 Nrf2 的胞浆抑制蛋白，正常情况下锚定于胞浆的肌动蛋白细胞骨架上。

人类 Keap1 蛋白一级结构含有 5 个结构域[2]：

• ①NTR 区，N 端区域。
• ②BTB 区，常形成二聚体结构，是 Keap1 与 Cul3（Cillion 3）作用的区域，可介导 Nrf2 的泛素化及蛋白降解。当该区域的 Cys151 发生突变时，可使 Keap1 与 Cul3 的作用解离，导致 Nrf2 不被泛素化。 
• ③IVR 区，该区域不仅富含半胱氨酸，而且含有 Keap1 活性最强的半胱氨酸残基，是整个蛋白的功能调节区，不但参与亲电试剂及氧化剂的反应，其 Cys273 和 Cys288 等半胱氨酸位点还与 Nrf2 的泛素化有关。在氧化应激条件下，这些位点被诱导剂所修饰降低了 Nrf2 的泛素化。
• ④DGR 区，又称 Kelch 区，含有 6 个重复的 Kelch 区域形成经典的 β 螺旋结构，含有多个蛋白质结合位点，既是 Keap1 与 Nrf2 的 Neh2 区的结合位点，也是 Keap1 与胞浆肌动蛋白的结合位点。
• ⑤CTR 区，C 端区域。

（2）Keap1功能

人类 Keap1 蛋白共包含 27 个半胱氨酸残基（Cys ) ，其 中 7 个 Cys （Cys151、257、273、288、 297、434、13）对 ROS 和亲电试剂非常敏感，这些 Cys 的修饰可改变 Keap1 构象，参与氧化还原信号转导[4]。

Keap1 高表达于心和骨骼肌等组织器官中。生理状态下，胞浆内的 Keap1 起着结合器的作用，通过含有 E3 的 Cul3 泛素连接酶与 Nrf2 结合在一起，Nrf2 作为目标被蛋白体酶降解。 当氧化应激反应出现，Keap1 作为氧化还原反应的传感器，它末端敏感的半胱氨酸残基通过氧化还原反应产生高效分子（如亲电子试剂）而被修饰，导致其构象发生变化，从而使 Nrf2 解离，转入细胞核内发挥作用[2]。

2、Nrf2

（1）CNC调节蛋白家族

Cap-n-Collar（CNC）调节蛋白家族尽管在 DNA 结合域和亮氨酸拉链域上有着高度同源性，却具有各自不同的生物学功能。该蛋白家族包括[2]：

• NF-E2（nuclear factor erythroid-2，核因子E2）
• Nrf1（NF-E2 related factor-1，核因子E2相关因子1）、Nrf2、Nrf3
• Bach1（BTB and CNC homology 1，BTB-CNC异体同源体1）、Bach2

（2）Nrf2结构

Nrf2 蛋白相对分子质量为 6.6×10^4，是具有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构（basic leucine zipper， bZip）的转录因子。在未受诱导的正常细胞里，Nrf2 的代谢是相当快的，半衰期（T1/2）只有10~30 min[2]。

不同种属（如人、鼠、鸡等）的 Nrf2 基因均含有 6 个高度保守的 ECH 相关蛋白同源结构域（Nrf2-ECH homology，Neh），分别被命名为 Neh1~6[2]。

• ①Neh1 区含有一个 C 端 bZip，bZip 通过与细胞核内小 Maf 蛋白（small Maf proteins，包括MafG、MafK、MafF）形成异二聚体，使 Nrf2 能识别 ARE 并与之结合，从而启动目标基因转录。
• ②Neh2 区是 Nrf2 与 Keap1 的结合区，含有 DLG 和 ETGE 两个结合位点。Neh2 区通过蛋白酶介导 Nrf2 降解而对 Nrf2 活性进行负性调节，与 Nrf2 的 转录活性密切相关。
• ③Neh3 位于 Nrf2 的 C 端，与细胞转录活性密切相关。
• ④Neh4 和 Neh5 位于 Neh1 和 Neh2 之间，对 Nrf2 目标基因的转录活化起着重要作用。当 Nrf2 进入细胞核，以 Nrf2-Maf 的形式与 ARE 结合后并不能立即启动转录，尚需 Neh4、Neh5 与共激活因子 CREB（cAMP response element binding protein，cAMP 反应元件结合蛋白）相互作用，才能启动转录过程。
• ⑤Neh6 区域是一段非 Keap1 依赖的富含丝氨酸的 Nrf2 降解调控区域，与 Nrf2 的负性调节有关。

（3）Nrf2功能

Nrf2 主要与其抑制剂 Keap1 结合，以其非活性状态存在于胞浆中，在泛素蛋白酶体途径作用下迅速降解，以保持在生理状态下 Nrf2 的低转录活性。当细胞受到活性氧（ROS）或其他亲核剂刺激后，Nrf2 与 Keap1 解偶联，活化的 Nrf2 转运进入细胞核，与 Maf 蛋白结合成异质二聚体后与 ARE 结合， 激活靶基因表达，调控Ⅱ相代谢酶、抗氧化酶或药物转运体的转录活性，从而发挥抗氧化损伤作用，恢复细胞的内稳态。随后，Keap1 进入细胞核内，与 Nrf2 一起出核并使 Nrf2 在胞浆内持续被蛋白体酶降解，Nrf2 水平下降，激活终止[2]。

（3）Nrf2磷酸化

Nrf2 的 Neh2 区上有个 degron 结构，是该区的丝氨酸残基。Nrf2 可被蛋白激酶C（PKC）家族中的很多成员磷酸化，其被 PKC 磷酸化作用的位点在 Ser40。发生氧化应激时，Nrf2 的 degron 区可被磷酸化而使构象改变，阻碍了泛素化依赖蛋白酶作用的蛋白降解途径中的由 E3 泛素化连接酶对 Nrf2 上 degron 结构的识别，即减弱了蛋白酶对 Nrf2 的识别与作用过程，从而使 Nrf2 的稳定性与含量增加，同时激活了其固有的转录活性[2]。

（4）门闩和枢纽学说

在细胞质中， Keap1 二聚体的两个 DGR 区分别与 Nrf2 的 DLG 和 ETGE 两个结合位点相结合，从而介导 Nrf2 的泛素化降解。一旦遭受到亲电试剂或者氧化剂刺激时，亲和力相对较低的 DLG 位点就会从 DGR 区上解离下来，然而具有高亲和力的 ETGE 位点仍然牢固地结合在 DGR 上，于是 Nrf2 就不能再被泛素连接酶识别而被泛素化降解。同时，整个过程中 Keap1 的位点仍被 Nrf2 占据， 新生成的 Nrf2 由于 Keap1 的位点饱和而不能被结合，所以就会以游离状态源源不断地进入细胞核与 Maf 蛋白结合成二聚体，识别并与 ARE 结合，从而发挥转录活性，促进 ARE 介导的下游靶基因的表达[2]。

（5）非经典途径：p62-Nrf2

当胞内 p62 大量聚集，可与 Nrf2 竞争结合 Keap1，导致 Nrf2 与 Keap1 解离，继而入核启动下游保护性基因的表达（见帖：p62/SQSTM1）。p62-Keap1 复合物的形成导致 Keap1 在自噬体中隔离并通过自噬而降解。此外，p62 是 Nrf2 的转录靶标，氧化应激时，Nrf2 转录激活并诱导 p62 产生，进而再次激活 Nrf2，在 p62 和 Nrf2 之间形成一个正反馈环[4]。

3、ARE

抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）是细胞保护蛋白的基因启动子区域的一段 5′-TGACnnnGC-3′ 的核心保护序列，是机体重要的抗氧化反应元件，许多Ⅱ相代谢酶基因的 5-启动区都含有 ARE，这一序列能被多种氧化性和亲电性化合物激活。研究证实，Nrf2 和 Bach1 均可与 ARE 结合，启动Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶的基因表达，从而保护机体组织细胞的正常功能[2]。

二、下游靶蛋白

Keap1-Nrf2-ARE信号通路被激活后，可启动下游多种靶蛋白的表达。这些靶蛋白能在被激活后调节机体内氧化还原平衡，使机体从氧化应激状态恢复到正常的生理状态。Nrf2 结构的特异性，导致了其激动剂的多样性，同时伴随其下游靶蛋白的多样性[2]。

Nrf2 调控的下游靶蛋白目前已被证实分为[2]：

• ①Ⅱ相代谢酶；
• ②抗氧化蛋白/酶；
• ③蛋白酶体/分子伴侶；
• ④抗炎因子；
• ⑤Ⅲ相代谢酶（即药物转运体）。

目前 NQO1、HO-1、γ-GCS 是 Nrf2 下游众多靶蛋白中最受关注，也是研究最多的抗氧化蛋白[2]。

1、Ⅱ相代谢酶

Ⅱ相代谢酶是细胞在遭遇异源性物质、致癌物等氧化应激损伤时或细胞毒性、 基因突变、致癌性等可能性增加时发挥细胞保护作用的蛋白酶，又称Ⅱ相解毒酶或Ⅱ相抗氧化酶。进入体内的致癌物质、环境污染物等一般在体内要经历两相代谢过程。首先在Ⅰ相代谢酶（如细胞色素 P450）的作用下，通过官能团反应转化成有活性的物质，从而对机体造成一定的损伤及危害。而Ⅱ相代谢酶则可通过增加其亲水性，从而促使它们排出体外，避免了对机体的进一步危害[2]。

Nrf2 信号通路调控的Ⅱ相代谢酶主要包括[2]：

• 谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferases，GST）；
• 醌氧化还原酶-1（NADPH: quinone oxidoreductase 1，NQO1）；
• 葡萄糖醛酸转移酶1A6（UDP-glucuronyl transferase 1A6，UGT1A6）；
• 黄曲霉素B1醛还原酶；
• 微粒体环氧化物水解酶。 

（1）NQO1

醌氧化还原酶-1（NQO1）是真核生物细胞中普遍存在的一种黄素蛋白酶，含有 274 个氨基酸，具备抗氧化能力，它能借助 NADH 或 NADPH 作为电子供体，催化醌类及其衍生物还原并使其毒性降解，从而阻止它们进一 步参与氧化还原反应和产生 ROS，使细胞在各种代谢引起的氧化应激反应中得到保护[2]。

NQO1 与其他代谢酶一起在体内构成了代谢网以抵抗外来毒性物质，它在机体的解毒代谢中起重要作用。研究显示，NQO1 为 Nrf2 的下游产物，Nrf2 的激活可刺激 NQO1 的表达[2]。

2、抗氧化蛋白/酶

机体存在两类抗氧化系统，一类是酶抗氧化系统，包括 SOD、CAT、GPx 等；另一类是非酶抗氧化系统，包括麦角硫因、维生素C、维生素E、谷胱甘肽、褪黑素、α-硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素（铜、锌、硒）[2]。

Nrf2 信号通路调控的抗氧化蛋白/酶主要包括：HO-1、CAT-1、SOD、GPx、γ-GCS等（CAT-1、SOD、GPx、γ-GCS 见贴：氧化应激）[2]。

（1）HO-1

血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是血红素降解的限速酶，广泛分布于机体组织，主要位于滑面内质网中，可将血红素催化分解生成等摩尔数的 CO、胆红素、铁。迄今为止己发现有 3 种 HO 同工酶，分别为 HO-1（氧应激诱导型）、HO-2（组成型）、HO-3（尚未明确）[2]。

研究报道显示，HO-1 属于诱导型，应激、低氧、热休克、内毒素、细胞因子、血红素、重金属及氧化剂等多种因素均可诱导 HO-1 的表达和增强其酶的活性。HO-1 不仅在机体的生理状态下发挥作用，更主要是在机体应激状态或其他非正常状态下发挥重要作用[2]。

HO-1 发挥抗氧化作用主要与两方面有关：一方面 HO-1 阻止游离血红素参与氧化反应，另一方面 HO-1 可与其酶解产物 CO、胆红素一起共同发挥抗氧化、抗炎、扩张血管、改善组织微循环和抑制细胞调亡等作用[2]。

3、蛋白酶体/分子伴侣

蛋白酶体是细胞调控特定蛋白和除去错误折叠蛋白的主要场所。蛋白酶体的降解途径在许多细胞进程，如基因表达调控、细胞周期、氧化应激反应中都起着重要的作用。包括热休克蛋白在内的分子伴侣家族主要是协助新生肽链折叠组装成有功能的蛋白质。26S 蛋白酶体主要包括 20S 核心颗粒，19S 调节颗粒、11S 调节颗粒[2]。

转位入核的 Nrf2 与蛋白酶体β亚基的 ARE 或亲电反应元件（electrophile response ele⁃ ment，EpRE）区域相结合，以使 20S 蛋白酶体核心颗粒和 11S 蛋白酶体调节颗粒的表达量大幅度提高，从而降解氧化蛋白，应对细胞的氧化应激[2]。

4、抗炎因子

HO-1 作用于血红素分解的副产物有强有力的抗炎作用，可以选择性地抑制脂多糖（lipopolysaccha⁃ rides，LPS）诱导的 TNF-α、IL-1、MIP-1β（macrophage inflammatory protein-1β，巨噬细胞炎症蛋白-1β）[2]。

Nrf2 可通过 HO-1 等负性调控各种细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）、趋化因子、细胞黏附因子、基质金属蛋白酶（MMP）、 环氧化酶-2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶等炎性介质，从而在炎症导致的功能紊乱中发挥保护作用[2]。

5、Ⅲ相代谢酶

药物转运体，又称Ⅲ相代谢酶，是人体组织生物膜存在介导药物跨膜转运的特殊转运蛋白。研究发现按其转运的不同方向，药物转运体大致可分为两类[2]：

• 一类可转运底物进入细胞，增加细胞内底物浓度，为摄取性转运体，如有机阴离子多肽转运体（organic anion transporting polypeptide，OATP）、有机阳离子转运体（organic cation transporter，OCT）、肽转运体（peptide transporter，PEPT）等；
• 另一类是依赖 ATP 分解释放的能量，将底物逆向泵出细胞，降低底物在细胞内的浓度，为外排性转运体，如 P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-related protein，MRP）、 肺耐药蛋白（lung resistance-related protein，LRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等。

这些转运体广泛存在于大部分器官，且在药物的吸收、分布及代谢等过程有重要作用[2]。

三、调节剂

（1）淫羊藿苷

淫羊藿苷（Icariin）是从淫羊藿（植物，一种中药材）中分离得到的丙烯化黄烷醇苷。淫羊藿苷通通过 Nrf2 信号通路对 ROS 诱导的人NP细胞氧化损伤和线粒体介导的凋亡具有保护作用[3]。

（2）金丝桃苷

金丝桃苷（Kinsenoside，Kin），又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，提取自Anoectochilus roxburghii（金线兰，一种广泛分布于热带的草药）。金丝桃苷可激活人 NP 细胞中的 AKT-ERK-Nrf2 信号通路，在体外减少线粒体功能障碍、凋亡和衰老[3]。

（3）番茄红素

番茄红素（Lycopene）是一种天然存在的类胡萝卜素，可从番茄、番茄制品和其他红色水果和蔬菜中提取，具有天然类胡萝卜素中最强的抗氧化能力。番茄红素通过激活与 p62 密切相关的 Nrf2，有效减弱 H2O2 诱导的人 NP 细胞凋亡[3]。

（4）豆蔻明

豆蔻明（Cardamonin，Cardamomin，CAR）是一种来自高山草和其他植物的查尔酮提取物，在体外和体内穿刺诱导的大鼠 IVDD 模型中对 NP 细胞具有保护作用。CAR 的治疗通过激活大鼠 NP 细胞中的 Nrf2/HO-1 信号轴显著抵消 ECM 降解和炎性细胞因子的释放[3]。

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参考文献

[1]Li Y, Chen L, Gao Y, Zou X, Wei F. Oxidative Stress and Intervertebral Disc Degeneration: Pathophysiology, Signaling Pathway, and Therapy. Oxid Med Cell Longev. 2022 Oct 10;2022:1984742. doi: 10.1155/2022/1984742. PMID: 36262281; PMCID: PMC9576411.

[2]胡流芳,王迎,任汝静,霍海如,孙建辉,李洪梅,朱亚英,谭余庆.Keap1-Nrf2/ARE信号通路的抗氧化应激作用及其调控机制[J].国际药学研究杂志,2016,43(01):146-152+166.DOI:10.13220/j.cnki.jipr.2016.01.022.

[3]Wang DK, Zheng HL, Zhou WS, Duan ZW, Jiang SD, Li B, Zheng XF, Jiang LS. Mitochondrial Dysfunction in Oxidative Stress-Mediated Intervertebral Disc Degeneration. Orthop Surg. 2022 Aug;14(8):1569-1582. doi: 10.1111/os.13302. Epub 2022 Jun 8. PMID: 35673928; PMCID: PMC9363752.

[4]高雅然,胡明,吕佩源.选择性自噬接头蛋白p62与Keap1-Nrf2信号通路在神经退行性疾病中的研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志,2020,47(04):439-442.DOI:10.16636/j.cnki.jinn.2020.04.021.