Cell Death Dis.(Q1，9.685) | STAT6调节P53/SLC7A11通路抑制铁死亡减轻急性肺损伤

文章题目：STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury via regulating P53/SLC7A11 pathway

发表期刊： Cell Death Dis.

影响因子：9.685

发表时间：2022年

发表单位：重庆大学市中心医院

样品类型：Human THP-1 acute monocytic leukemia cells and immortalized human bronchial epithelial HBE cells，C57BL/6, STAT6^flox/flox and Sftpc^Cre mice

运用技术：HE，IHC，qRT-PCR，WB，IP，shRNA，间接免疫荧光，细胞活力，双荧光素酶报告基因，ChIP，TUNEL测定

背景

急性肺损伤（ALI）是由肺和肺外因素引起的一种常见临床综合征，其最严重后果—ARDS（急性呼吸综合征）在没有有效的靶向干预的情况下会导致高发病率和死亡率。已有研究证实，在ALI的发病机制中，炎症、凝血和氧化应激起着重要作用，这些机制会导致炎症细胞浸润、肺水肿、动脉低氧血症，最终导致肺组织功能障碍。

细胞外高水平谷氨酸、胱氨酸缺乏、氨基酸缺乏等生理条件可引发铁死亡。抑制Xc-系统（胱氨酸/谷氨酸转运体）、GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）也可诱导铁死亡。SLC7A11是Xc系统的一个亚单位，通过转运细胞外半胱氨酸对铁超载属性的铁死亡起关键调节作用。抑制SLC7A11能降低胱氨酸摄取，增强细胞内脂质过氧化和铁死亡。乙酰化的P53可以抑制SLC7A11，进而抑制半胱氨酸的摄取，促进铁死亡。信号转导子和转导激活子6（STAT6）是先天性免疫应答的关键调节因子，调节STAT6可以通过促进M2巨噬细胞极化来抑制炎症反应。

结果

1、ALI中，STAT6的表达和激活随着铁死亡的诱导发生而上调

为了确定铁死亡在ALI中的作用，建立CS和LPS诱导的ALI小鼠模型，并用Ferr-1和DFO进行治疗。CS和LPS诱导ALI后，PTGS-2表达量和铁含量均上升；小鼠肺组织中出现明显的炎性细胞浸润，肺泡隔增厚；其次，MDA含量升高，GSH含量降低，8-oxo-dG水平上调，BALF中蛋白质和LDH水平增加；而这些变化均可被Ferr-1和DFO抑制扭转。此外，TUNEL染色结果显示，CS或LPS处理后，仅观察到少量阳性染色细胞。这些数据表明，铁死亡可能是刺激诱发ALI的主要因素。

  CS、LPS和X射线诱导ALI后，STAT6 mRNA表达量（图1A）、STAT6和p-STAT6的蛋白质水平均增加（图1B），STAT6易位至细胞核（图1C），STAT6细胞核核蛋白表达增加（图1D）。上述数据表明，在上述ALI期间，STAT6信号随着铁死亡的诱导而增加。

图1 STAT6 在 CS、LPS 和 X 射线诱导的急性肺损伤铁死亡中被激活

2、敲除肺上皮细胞中的STAT6可加重铁死亡并加重肺损伤

为了研究STAT6与铁死亡之间的关系，作者根据STAT6的中位表达将CS诱导的肺损伤动物模型（GSE32147）分组，并比较它们的基因表达谱，发现共有826个基因（437个上调，389条下调）发生了显著变化（图1E）。通过GSEA分析进一步研究STAT6与肺组织铁死亡之间的关系。观察到铁死亡的标记基因在STAT6低表达的肺组织中显著富集（图1F）。这些结果表明STAT6与ALI的铁死亡呈负相关。

接下来，用STAT6^{flox /flox}和Sftpc^cre小鼠杂交产生的肺上皮特异性STAT6 缺陷小鼠（STAT6^cKO）构建ALI模型，注射三苯氧胺以诱导cre的活性。发现CS滴注后，肺重量与体重的比率（LW /BW）增加（图2A，B），小鼠肺组织出席炎性细胞浸润和细胞结节（图2C），8-oxo-dG（图2D）、PTGS-2（图2D-F）、MDA、铁含量和4-HNE表达升高，GSH表达下降（图2G-J）。说明CS诱发小鼠肺组织铁死亡，而STAT6^cKO小鼠情况更为严重。

为了验证因STAT6缺陷而加重的铁死亡是否广泛存在于ALI中，作者还建立了LPS和X射线诱导的ALI模型。与WT小鼠相比，STAT6^cKO小鼠在刺激后表现出更多的炎性细胞浸润和肺泡隔增厚，8-oxo-dG和PTGS-2水平进一步增加，GSH含量下降得更多，MDA和铁积累增加的水平更高（图S5、6）。这些数据表明，肺上皮中STAT6缺乏可促进铁死亡并加重肺损伤。

图2 肺上皮细胞 STAT6 缺乏会加重 CS 诱导的铁死亡和肺损伤

3、STAT6积极调节SLC7A11并抑制铁死亡

SLC7A11是一个关键的铁死亡相关基因，在STAT6^cKO小鼠中观察到其表达降低。为了确定STAT6和SLC7A11之间的关系，将STAT6基因敲除小鼠的基因集按SLC7A11表达中值分组，构建GTEx样本并进行GSEA分析。在GSE1438中，具有最大log2FC的150个显著DEG被定义为受STAT6负调控的基因。同时，最小log2FC的150个显著DEG被定义为受STAT6正调控的基因。根据GSE1438表达谱，选择300个DEG到基因集（图3A左）。其中，77个上调基因和98个下调基因最终定位到智人的同源基因。然后，GSEA显示，受STAT6负调控的基因在SLC7A11低表达组中显著富集，而受STAT6正调控的基因在SLC7A11高表达组中富集（图3A右）。这些结果表明SLC7A11与STAT6信号呈正相关。

  为了研究STAT6调节铁死亡的详细机制，将分化的THP-1细胞用含CS的培养基培养24小时，收集细胞培养基以进一步处理HBE细胞（图3B）。检测发现，CS培养基处理上调了PTGS-2表达量（图3C，H，I），增加了MDA和铁含量（图3F，G），抑制了细胞活力，下调了GSH表达量（图3D，E）；沉默了STAT6后，这些变化进一步加剧；但STAT6过度表达扭转了这些变化。用LPS处理得到一致的结果。用经典的铁死亡诱导剂Erastin和RSL3证实STAT6在调节铁下死亡中的作用。结果表明，抑制STAT6后，铁和MDA含量进一步增加，GSH水平进一步下降。

  此外，在CS培养基或LPS处理后，SLC7A11的表达降低，随着STAT6的过度表达而恢复，随着STAT6的敲除而加重（图3H-I）。这些结果表明，STAT6恢复了铁死亡中SLC7A11的表达，并在抑制铁死亡中发挥重要作用。

4、STAT6通过降低P53乙酰化，下调其信号以减轻铁死亡

为了进一步探索STAT6对铁死亡的调节机制，作者选择了文献中报道的STAT6和铁死亡相关蛋白，建立蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并将计算出的前10个基因作为枢纽基因。网络图显示，P53是与STAT6相关的唯一枢纽基因，并且与网络中的其他节点密切相关，这表明STAT6可能通过P53调节铁死亡（图4A）。接下来，作者分别对按STAT6和P53表达中值分类的GTEx肺组织数据进行差异分析。结果表明，按STAT6和P53分组的显著差异表达之间有753个重叠（p<0.05）（图4B）。然后，根据STAT6表达水平，68个GTEx样本中753个常见DEG的表达情况如图4C所示，其中与氧化应激、脂质代谢和铁下垂相关的基因在侧条上注释。此外，作者还发现，KEGG数据库的P53信号通路基因集在STAT6低表达组中显著富集（图4D）。这些发现表明，STAT6通过负性调节P53信号来减轻肺损伤中的铁死亡。

随后，检测STAT6对P53信号的调节机制及其与SLC7A11的关联。用STAT6和P53质粒转染HBE细胞，收集细胞进行分析。结果表明，STAT6和P53之间没有直接结合，同时P53的位置不受STAT6的影响（图S8A-C）。随着STAT6的过度表达，P21的蛋白质和mRNA水平以及乙酰化的P53呈剂量依赖性降低,SLC7A11表达上升，而P53本身不受影响；而抑制STAT6则相反（图4E、G)。为了证实STAT6特异性调节P53的乙酰化，作者还使用Ack-pan抗体进行了IP分析，结果一致显示STAT6对P53的乙酰化具有负调节作用（图S8D）。在小鼠模型中，与野生型小鼠相比，STAT6^cKO小鼠肺组织中P53乙酰化和P21的蛋白水平显著增加，而SLC7A11的蛋白表达降低（图4F）。

此外，作者还证实了P53乙酰化是否调节CS或LPS诱导铁累积和脂质过氧化。如补充图S8F，G所示，TSA/NAM诱导了P53乙酰化后上调CS和LPS诱导的铁和MDA含量，而通过沉默CBP、抑制P53乙酰化则下调了增加的铁和MDA含量。综上所述，STAT6可能是通过抑制P53乙酰化，改善SLC7A11的表达从而抑制铁死亡。

图4 STAT6 下调 P53 信号通路，通过减少其乙酰化修饰来缓解铁死亡。

5、STAT6与CBP竞争性结合，消除P53对SLC7A11表达的抑制作用

为了证实STAT6通过P53调节铁死亡，对转染P53和STAT6的HBE细胞进行分析。如图5所示，P53过表达使得PTGS-2、MDA、铁水平进一步增加，细胞活力、LDH进一步降低，从而加重了CS诱导的铁死亡，而STAT6的过表达可以改善这种情况。

图5 STAT6 抑制P53过表达诱导的细胞铁死亡

接下来，作者进一步探讨了STAT6抑制铁死亡的分子机制。乙酰化的P53才能与响应元件（RE）相互作用，调节其靶转录，而CBP是P53乙酰化的关键乙酰转移酶。首先确定了CBP和STAT6之间能够相互作用（图6A）。敲除CBP抑制了CS诱导的PTGS-2表达，增加了SLC7A11启动子的荧光素酶活性（图6C-E）。此外，免疫沉淀试验表明过表达的STAT6与CBP竞争性结合，减少P53和CBP之间的结合，从而抑制P53乙酰化（图6B）。荧光素酶报告子分析显示，STAT6过表达或CBP敲除后，P53对SLC7A11启动子的抑制活性减弱（图6F-H）。，CBP的敲除降低了p53乙酰化，增加了SLC7A11的表达（图S8E）。这些数据表明，STAT6与CBP竞争性结合，以恢复P53对SLC7A11表达的抑制，从而改善铁死亡。

图6 STAT6 与 CBP 竞争性结合以恢复 P53 对 SLC7A11 表达的抑制

6、在CS和LPS诱导的模型中，挽救STAT6可抑制铁死亡，减轻肺损伤

接下来，在CS和LPS诱导的ALI模型中评估慢病毒介导的STAT6过度表达。肺组织的荧光图像显示了lenti-Veh组和lenti-mouse STAT6组的感染效率（图7A）。如图7所示，静注STAT6后，小鼠肺组织中STAT6的表达显著升高；而肺重/体重，BALF蛋白、8-oxo-dG、PTGS-2表达量、MDA和铁含量显著下降，GSH含量升高，病理损伤和氧化应激得以恢复，缓解了CS和LPS引起的铁下。这些结果表明，静注STAT6可减轻小鼠肺组织的铁死亡并改善ALI。

图7 CS 和 LPS 诱导的模型中，STAT6 的拯救可减轻铁死亡和急性肺损伤

总结

本研究揭示了STAT6和CBP竞争性结合，减少P53乙酰化，减少其对SLC7A11的抑制，并最终抑制铁死亡的机制（图8），为治疗ALI提供一种潜在的治疗方法。

STAT6 对铁死亡的调节模型图