重磅：Western Blot基本原理和配胶

亲爱的小伙伴们，大家好，今天我们要讲解的是，Western Blot基本原理和配胶，简单好用以及精确，学完之后，相信你对Western Blot基本原理和配胶将不再陌生。接下来就开始今天的学习吧！

Western Blot的目的和原理：

其目的是为了检测蛋白质的表达水平。它的原理主要是通过聚丙烯酰胺胶SDS-PAGE电泳,把蛋白质按分子量大小区分开来，接下来把蛋白质转移到固定的载体上，例如：PVDF膜，接着，将目标蛋白用一抗标记，然后一抗用二抗标记，最后再通过显色或是显影来显示二抗，从而算出一抗以及目标蛋白。

配胶背景

当进行SDS-PAGE电泳时，首先应先准备电泳相关的设备，耗材和试剂，电泳相关设备包括：电泳槽和电源，以及制胶的配套耗材和试剂，制胶的完整的配套耗材包括：首先是这么一个结构，上图：

两边叫做制胶架，将制胶架组合在一起，变成了制胶框，制胶框有两个凹槽，前后分别嵌入一块长短玻璃板，安装时要注意对齐，对齐后，要对装备的制胶设备进行密封性测试实验，具体操作很简单，直接往两块玻璃板的缝隙中注水，直到水面接近与短玻璃板持平，然后静止十分钟，并观察是否有漏液现象出现，如果有就重新装配，如果没有，就小心倒掉里面的水。并用滤纸吸干剩余的液滴。

接下来开始配胶：

 SDS-PAGE它是一种不连续的电泳，所以电泳用的凝胶包括两部分：浓缩胶在上方，以及分离胶在下方，配置时，一般先配分离胶，你可以根据目标蛋白的大小，配置合适浓度的分离胶，配置分离胶时，需要用到：丙烯酰胺溶液，过硫酸铵（APS），四甲基乙二胺（TEMED）,SDS，Tris碱，蒸馏水，实际供应商一般会提供配置好的分离胶，上图：

一定要注意：丙烯酰胺具有神经毒性，操作时，必须全程戴好手套，另外，如果你要自己配胶，注意四甲基乙二胺一定要最后再加入，因为他加入后，会使丙烯酰胺快速聚合。

配好的分离胶应快速用移液器加入玻璃板内，分离胶的液面高度要适当，加完后，在上方加入异丙醇或是水，使液面直至与短玻璃板顶端持平，主要是为了封闭分离胶的液面以及压实分离胶，使分离胶上方的液面平整，然后等待十五分钟，当我们看到胶和水层之间出现清晰的界面时，则代表分离胶已配置完成，此时需要倒掉液体，多余的水分用滤纸吸干净。浓缩胶的配置和分离胶的配置顺序和操作流程一样，配置好后，在分离胶上方灌注，直到液面与短玻璃板持平，接下来把制胶梳子插入液面，同时检查一下，是否有气泡，没有问题的话，等待30分钟，直到胶溶液完成聚合。

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