细胞表型分析新思路

      -基于阻抗方法实时、无标记、长期监测细胞表型

（可用于细胞增殖、肿瘤免疫、细胞毒性及活力检测、药物筛选、信号通路(GPCR/CFTR)、细胞间相互作用 (屏障功能)、病毒学研究及细胞迁移等细胞表型研究。）

细胞表型是涉及基因和蛋白表达的多个细胞过程的集合体，这些过程导致细胞特定的形态和功能。细胞表型检测主要类型有：细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭、活力、信号通路及屏障功能等。

针对细胞表型的检测方法主要为需要标记物的“终点法”。例如， 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因此MTT试剂盒可用于细胞存活及生长的检测。  LDH(EC1.1.1.27)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD/NADH之间互变。LDH催化NAD氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2, 4 -二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比，所以LDH试剂盒常用于检测细胞质膜的完整度。

这些标记细胞内产物的检测方法有很多局限性：

1.由于终点法的方法学限制，一般需要选择几个时间点进行测定。这样对于细胞的生理动态变化过程无法做到长期连续监测，往往会错过许多重要的节点和时间窗。

2.终点法实验的平行性差。由于每个时间节点都需要至少3个副孔，那么得到一条完整的曲线就需要至少十几个孔的数据。这样会导致平行性变差。

3.细胞毒性，标记物往往具有毒性，会影响细胞的正常生理状态。而且往往需要将细胞裂解，对裂解液进行检测。这就变成了一次性的样本，无法进行后续的实验处理。

4.灵敏度低，细胞内的被标记物质需要达到一定的含量才能够被检测到。否则，信号将被埋没在背景噪声中。

那么有没有一个不需要借助标记物就能够实现对细胞表型的实时、无标记、非侵入的检测呢？

接下来，介绍一下阻抗法在细胞表型分析中的基本原理和应用：

基本原理： 将细胞样本置于CytoView-Z阻抗板中（底部埋入电极的96孔培养板）进行培养，当细胞贴附于电极并伸展开后，将微小的电信号施加于电极上，细胞间形成的联接将阻挡这些电信号的通过，导致阻抗值的读数增加，而细胞结构形态上的细微改变（比如源于受体介导的信号传递或细胞形态学变化）也会影响阻抗值。也就是说，细胞的贴壁、黏附、增殖及形变等过程都会引起阻抗的变化，细胞的增殖数量与阻抗的呈现一个正相关的关系。

阻抗检测会计算有多少电信号（上图中青色箭头所示）被电极－细胞的界面所阻挡。当电极未被覆盖时，电信号能轻松穿过，这时阻抗值比较低。当细胞盖住电极时，能够通过的电信号就变少了，相应的阻抗值就会增大。当细胞死亡或者脱离电极时，阻抗值就会恢复到基线水平。

阻抗方法相比于传统的标记方法，具有

1.灵敏度高

能够检测出成像技术难以捕捉的、微小的细胞形态、构象变化；

2.长时间持续监测

不会错过药物反应时间框，在给药前可通过增殖曲线判断细胞状态；

3.无标记、原位

测量过程完全不会影响细胞生物学特性，无需优化抗体用量、染料浓度；

4.孵育时间等参数

自动采集数据，中间无需手动操作。

阻抗实验的一般流程

目前阻抗平台可用于细胞增殖、肿瘤免疫、细胞毒性及活力检测、药物筛选、信号通路(GPCR/CFTR)、细胞间相互作用 (屏障功能)、病毒学研究及细胞迁移等细胞表型研究。

具体的研究案例如下：

1. T细胞杀伤——监测免疫T细胞介导的细胞死亡

人体免疫系统中的效应T细胞，有着高特异性和固有的细胞毒性，被人们寄予很高的期望。Maestro Z的阻抗测试有着高灵敏、无标记及无损的特点，为连续监控细胞增殖和免疫细胞介导的细胞毒性提供了可能，因而被用来评估免疫效价。

2. 细胞毒性的动态研究

传统的终点法实验只能区分细胞样本的死活，而无法了解细胞反应的动态过程并对背后的机理做出解释。Maestro Z所提供的无标记、非侵入的连续监控能力，得以捕捉到细胞毒性的全程。不仅能看到毒性的程度，还能揭示其动态学和细胞死亡的速率。通过这些细胞反应的动态表现，更容易洞悉一个药物的效力及作用机理。

3. 生长曲线——细胞样本专属功能档案

基于各自不同的生物学功能，细胞样本间的生长、贴附及互作会有所不同。这些特性共同构成了一个独特的细胞档案。Maestro Z可以记录这些信息，并基于细胞各种特性（如种类、密度、形态和贴附）的不同来将它们分开归档。细胞功能档案可被用于细胞质控、纯度分析、量化生长速率和优化实验启动时间点等方面。这些功能的实现无需复杂的实验设定和分析。只需一个按键，Maestro Z系统就能稳定测试环境，长时间非侵入地监测细胞，提供实时的生长曲线和简明的终点圈示。

 我们将Hela细胞按照不同密度种入Maestro Z系统配套的CytoView-Z阻抗测试板内，并对其贴附、伸展及增殖的不同生长阶段开展监测。如左图所示，可以看到对应于这些阶段的实时阻抗记录。其中全部时间的终点数据（如第16个小时）都可以以柱状图的形式单独表示出来（如中图）。而从右图可以看出Hela、A549、Calu-3这三种不同细胞的生长曲线都不尽相同。

4. 跨膜信号传导——感知受体介导的快速信号传导

经由信号传导通路，细胞能够接收外界的信息。胞外信号分子与细胞表面的对应受体结合后，细胞内的信号传导就会被触发，并最终决定细胞的行为。跨膜受体中的最大家族是G蛋白偶联受体(GPCRs）。被结合后，它们将导致细胞构象的改变并引起下游的一系列反应。这些细微的变化通常发生迅速，但其对细胞生理的重大影响却能够持续几分钟至几个小时。通过阻抗检测，我们能够将其捕获并量化。Maestro Z的高灵敏度及连续监测特性，赋予您测试细胞信号传导动态的能力，无论这个过程有多久。

如左图所示，我们将Calu-3细胞培养在阻抗检测板中，随后加入不同浓度的异丙肾上腺素（一种强效β肾上腺素受体拮抗剂，图中青色所示），并观察阻抗值的实时变化。如果我们将20分钟时间点的数据做成柱状图（如中图所示），可以看到最高试剂浓度组的阻抗值在那时已经降到了最低，而最低试剂浓度组则已经回复到了基线值。我们还可以探索不同机理的化合物对于细胞信号传导的不同作用。如右图所示，橙色标识的组胺处理组（100µM）很迅速地出现了短时间的阻抗值降低；而灰色标识的细胞松弛素处理组，由于其细胞周期停止及肌动蛋白合成受抑制，则表现出前高后低的阻抗变化规律。

Maestro Z基于阻抗检测的细胞分析技术，使得实时、不间断且无需标记的细胞监测成为可能。对数据流的后续分析可以揭示细胞间互作和细胞-药物反应的动力学，可以更好地理解其机理而无需做费时费力的多次终点法实验。

祝大家实验顺利！

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