色谱峰保留时间，为啥漂移了？！

Q：我的色谱峰保留时间在飘移，这是为何？

A：这是个有趣的问题，可能有很多不同的原因，让我们一个一个来看。大多数人通常认为保留时间的飘移是平衡问题。如果你在使用未修饰的硅胶柱做正相色谱，那么这是最可能发生的问题。正相色谱的保留时间容易受到硅胶表面吸附的水含量的影响，结果使得水在流动相中溶解度低。因为水在正己烷或二氯甲烷等试剂中的溶解度非常低，所以色谱柱平衡需要很长的时间。我曾见过使用非常干燥的正己烷平衡一星期后保留时间仍然飘移的情况，所以建议避免使用非常干燥的试剂。通常解决硅胶和水的平衡问题的办法就是使用与水“半饱和”的试剂。制备方法是把一定体积的疏水试剂用水饱和后，再与相同体积的“干燥”试剂混合。这个方法可以极大的加快平衡时间。

在反相色谱中，平衡通常会很快。几个（5-10个）柱体积的流动相通常就足够平衡了，但不全然如此。值得注意的一个例外就是在离子对色谱中，使用离子对试剂平衡色谱柱。典型的离子对试剂使用浓度在2-5个mmol/L或者更少，它们吸附在反相色谱柱填料表面，表面浓度在0.5-2μmol/m2。1根250*4.6mm的色谱柱有大约3g填料，表面积约为330m2/g，这意味着一根色谱柱有大约1000m2的表面积，当表面平衡浓度为2μmol/m2，需要2mmol的离子对试剂进行完全的柱平衡。当流动相浓度为2mmol/L时，需要1L的流动相进行平衡。这虽然是极端状况，但如果用几百毫升的流动相去平衡色谱柱也不必大惊小怪。因此在离子对色谱中将离子对试剂转换为有机溶剂来过夜保存色谱柱是不明智的，因为离子对试剂被清除后，第二天你又要花很长时间去平衡。

Q：所有这些现象都有共同的因素：流动相含有低浓度的强吸附试剂。这是保留时间飘移最常见的原因么？

A：我想就是那样的，其它的现象不多见。但是强吸附剂也可能源于样品。这种情况下它们在重复进样中会慢慢累积，从而改变色谱柱的化学性质。举个例子，药品中的赋形剂。

我们可以通过观察保留时间变化的速率来得知杂质是从流动相中引入还是从样品中引入。

实验如下：

1、进样几次，例如，4次一共1小时进样。

2、走相同量的流动相，不进样。

3、重复第一步。

4、做一个关系图，保留时间。

5、对时间的关系

6、对进样次数的关系

7、如果第一个图得到一条平滑的曲线，那么流动相是引入杂质的原因。如果第二个图得到一条平滑曲线，那么杂质的来源是样品。 

Q：还有其它保留时间飘移的原因么？

A：是的，还可能是由于流动相的组成随着时间改变导致保留时间飘移。如果你没有使用仪器的在线混合装置，那么流动相的组分可能在缓慢的蒸发。当使用氦气流喷射排气泡时，通常会有这种情况发生，所以必须将喷射的速率控制到最小。

此外，一个经常被忽视的原因就是键合相的水解。制造商通常会指定一个pH范围，超出范围可能导致键合相“不稳定”。这个范围通常是pH 2-8或9。然而，人们会有很多原因不得不接近这个极限。然而它并没有一个明显的分界线，因为水解还取决于其他因素如温度或有机溶剂，因而缓慢的水解也可能发生在这个极限范围内。

要保持固定相的水解稳定性，最好是在中性pH值（通常在pH 3~5左右）和低的温度。等度条件优于梯度条件。在等度条件下发生水解的过程中，键合相通常会自我吸附，并达成一种区域平衡。然而，在使用高浓度的有机溶剂时，例如在梯度洗脱或者冲洗色谱柱的过程中，这种平衡被打破，键合相会被冲洗出色谱柱。

Q：我会记住这些的。温度变化也会导致保留时间飘移么？

A：是的，温度通常会被怀疑。如果你的样品是自动分析过夜或者过了周末的，那么你得到的保留时间飘移的结果可能和实验室温度变化有关。在许多地方，为了节能，室温的设置在晚上或者周末通常是不一样的。通常来讲，1℃的变化导致保留时间飘移大约1%到2%。这个可以联系最后一个导致保留时间飘移的原因—色谱柱返压的增加。增加的返压表明色谱柱被污染，但是仅仅是堵塞的筛板就足以导致保留时间的飘移。为了使流动相通过筛板，需要额外的压力来促使流动相通过筛板，这会使得流动相在摩擦过程中受热，从而导致保留时间的飘移。

此外，还有其他的一些原因，但是极少发生。

在反相色谱上发生平衡很慢的现象是由于流动相中有机溶剂比例太少。高键合覆盖率、“完全封端”的C18没有被流动相良好的“润湿”。这会导致一些现象，源于流动相和固定相没有很好的接触，造成的“疏水塌陷”，“疏水塌陷”是由于键合相卷曲，固定相之间的相互吸附，从而导致固定相可用于和样品相互作用的表面积的减少。这时候立即用一定量柱体积的有机溶剂冲洗可以使色谱柱，最好是在你的流动相中加入有机调节剂。这类现象在所有没有被封端的固定相上很少发生，甚至不会遇到。

保留时间漂移的故障排除

保留时间不重现有两种不同的情况：既保留时间漂移和保留时间波动。

前者是指保留时间仅沿单方向发生变化，而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如，保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。

保留时间漂移的几种最常见的原因如下：

一色谱柱平衡。如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。

流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。

固定相稳定性。固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的PH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例如，硅胶基质在pH4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。

经常清洗色谱柱亦会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。三色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。

HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。

样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化合物，食品样品中的淀粉，环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取（SPE）等样品前处理方法来去除样品基质的影响。

避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。如THF可去除反相色谱柱中的许多污染物，但蛋白在THF中就不能溶解。

使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。四流动相组成流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。五疏水坍塌当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时，有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象，这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相，再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱或非端基封口的色谱柱也可避免发生坍塌。

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