提取高质量的RNA和实验操作步骤
什么是RNA提取
细胞中的RNA可以分为信使RNA，转运RNA和核糖体RNA=大类.不同组织总RNA提取的实质就是将纸胞裂解.释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白.DNA等杂质.最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取的使用目的
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA可用干实时荧光定量PCR，Northern blot. microRNA检测、芯片分析,DNA文库构建.基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验.其质量要求不尽相同。
cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留Northern对RNA完整性要求较高.对酶反应抑制物残留要求较低RT-PCR对RNA完整性要求不太高.但对酶反应抑制物残留要求严格。因此明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
RNA提取的方法
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后.RNA通过导丙醇沉淀向收。移去水相后 用7醇可从中间相沉淀得到DNA加入县丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
RNA提取实验操作步骤准备试剂:
氯仿异丙醇75%乙醇无RNase的水或0.5%SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。操作步骤:
1.匀浆处理
a)植物组织:
以叶片RNA提取为例 取新鲜叶片在液氢中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨.研磨要迅速 最好不要超过1min,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol
b)动物组织:
以鼠肝脏RNA提取为例 取新鲜或-70C冻存组织每50-100mg组织加1ml Trizol.用匀浆仪进行匀浆处理样品体积一般不要超过Trizol体积的10%
c)单层培养细胞
直接在培养板中加入Trizol到解细胞每10cm2面积加加1ml Trizol用取样器吹打几次
注意Tnizol加量根据培养板面积决定不是由细胞数决定如果Trizol加星不足.可能导致提取的 RNA中有DNA污染
d)细胞悬液
离心取细胞每5-10x106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞 以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理
e)血液处理
直接取新鲜的血液加入3倍体和红细胞型解液混匀后室温放置10min.10 000rpm 意心1min，弃上清 收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2.将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:4℃ 10 000rpm离心10min 取上清。
1.如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等 可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA 上清中含有RNA，处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂.应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4.每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s.室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替，
5.4℃ 10 000rpm离心10-15min 样品会分成三层·红色的有机相.中间层和上层无色的水相.RNA主要在水相中把水相(约600ul约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA.可保留黄色的有机相)
6.在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀-20℃ 放置20-30min
2.植物或动物组织RNA提取中容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步馨操作减轻污染在上清中加入1/2体积的异丙醇1/2体积的RNA助沉剂然后进行以下操作。
7.4C 10 000rpm离心10min,去上清。
3.离心前RNA沉淀经常是看不见的.离心后在管侧和管底形成胶状沉淀
8.加入1ml75%乙(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
9.4℃ 10 000rpm离心2min,弃上清 短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀
10.室温放首晾干(不要晾得过干.RNA完全干燥后会很难溶解.大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应 勿使用SDS溶液。RNA也可用100% 的去离子甲酰胺溶解-70℃保存。
RNA提取的注意事项
1.从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞):
加800ul Trizol样品裂解后加氯仿分层沉淀RNA前.加5-10ug RNase-free糖原 糖原会与RNA一同沉淀出来 糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录CDNA第一链的合成也不影响PCR反应。
2.匀浆后 加氯仿前 样品可在-70C放置一个月以上RNA沉淀可以保存在75%酒精中2-8一个星期或-20℃一年以上。如果要长期保存.RNA可以溶解于100%去离子田酰胺中-70C长期保存
