缺氧居然是促进肿瘤的发生的原因？

我们都知道，乳腺癌的发病原因有家族史与乳腺癌的相关基因、生殖因素、内源性的激素或者是外源性的激素、营养因素、大剂量辐射等等。但除掉这些，缺氧也可以促进肿瘤的发生和发展，那么今天我们来看看，缺氧的条件下EGFR抑制剂是否会对乳腺癌的敏感性更强。

这次分享的文献题目是：Hypoxia alters the response to anti-EGFR therapy by regulating EGFR expression and downstream signaling in a DNA methylation-specific and HIF-dependent manner，影响因子为9.728分，发表在Cancer Res.杂志上，发表时间为2021年5月。

该文章主要探究了：缺氧条件下的部分乳腺癌细胞，通过DNA甲基化的作用机制，降低了HIF-1α在EGFR基因上结合位点的甲基化水平，从而促进了EGFR的表达，在这种情况下，EGFR抑制剂对乳腺癌细胞的敏感性更强。

本篇文章的研究背景是这样的：缺氧可促进肿瘤的发生发展，作者的近期研究表明缺氧对一些保守基因有独特的转录反应，此文献中选择了表皮生长因子受体(EGFR)作为研究对象；EGFR在癌症中过表达，参与激活多条信号通路，在癌症的发生发展中起着不容忽视的作用；正常情况下，EGFR的表达主要受其mRNA的调节，在胶质瘤中也以此机制调控其表达，但在其它实体瘤中mRNA调节其表达不常见；已有文献表明，在多种癌症中，EGFR启动子区域的高甲基化改变了EGFR的表达情况；然而，EGFR低甲基化是否以及如何改变基因表达，还没有被研究过。因此，此篇文献作者着眼于在乳腺癌细胞高表达的EGFR的作用机制的研究和探讨。

接下来通过作者得到的实验结果来分析这篇文章吧!

一、缺氧条件下，EGFR表达在部分乳腺癌细胞株中被诱导

在作者的前期工作中，对31种乳腺癌细胞株在20%或1%氧气条件下暴露24小时进行了RNA测序分析，发现每株细胞株中均有1000个以上基因被诱导或抑制，但只有42个基因对低氧诱导起保守效应，其中就包括在部分乳腺癌细胞株高表达的EGFR。为了确认这一结果，作者在这里也通过qPCR检测了低氧诱导后31株乳腺癌细胞株中EGFR的表达，发现只有7株细胞中的EGFR表达被诱导了2倍甚至更高（Fig.1A）。接下来选择了6株管腔细胞系和5株基底细胞系来检测EGFR表达情况，6株管腔细胞系的EGFR在缺氧条件下全部被诱导，而基底细胞系只有1株细胞被诱导（Fig.1B-D）。考虑到管腔细胞表达雌激素受体（ER），而基底细胞不表达，推测ER可能影响了EGFR的表达。在缺氧条件下，采用4-羟基他莫昔芬(OHT)或氟哌啶醇抑制ER，或采用ER cDNA过表达ER，都未能影响EGFR的表达（补充材料）。在TCGA数据库中得到，管腔(ER+)或基底(ER-)乳腺癌样本患者中，EGFR表达与缺氧评分表达相关，从而排除ER对EGFR表达的影响。以上结果说明，在缺氧条件下，只有部分乳腺癌细胞株中EGFR表达被诱导，且跟ER无关。

二、缺氧条件下，EGFR表达被诱导依赖于HIF-1α

肿瘤细胞生存和适应缺氧条件，部分是通过激活缺氧诱导因子1 (HIF-1)和HIF-2，诱导参与血管生成、葡萄糖利用、侵袭和转移的基因产物的表达，因此，推测HIFs可能影响了EGFR的表达。采用CRISPR技术敲除HIF-1α和HIF-2α，结果得到，缺氧条件下诱导的EGFR高表达效应被敲除HIF-1α阻断了，而敲除HIF-2α对EGFR表达没有影响（Fig.2A-B），说明EGFR的表达依赖于HIF-1α。接着，作者探究了EGFR下游通路的影响。在缺氧和正常氧气条件下，EGF刺激30分钟后AKT和ERK的磷酸化水平均增加（Fig.2C）， 在缺氧条件下，敲除HIF-1α或加入EGFR抑制剂后，阻断了AKT和ERK的磷酸化水平（Fig.2D-E）。以上结果说明：缺氧条件下HIF-1α增加EGFR表达，激活 EGFR的下游通路。

三、EGFR基因包含一个功能性缺氧反应元件，也就是HIF-1α与EGFR的结合位点

前面的结果已经说明HIF-1α能影响EGFR的表达，为了进一步确定HIF-1α是否是EGFR的直接转录调控因子，作者通过文献查找EGFR基因中公认的HIF-1α结合位点。从一项研究中使用暴露于0.5% O2或2mM DMOG的MCF-7细胞中HIF结合位点的高分辨率全基因组定位发现：在EGFR基因座的第18内含子中存在一个高强度的HIF -1α结合区域（Fig.3A）。同时用ChIP实验进一步确认了第18内含子的结合区域，并排除了第17内含子区域（Fig.3B），由于31株乳腺癌细胞株中只有7株在缺氧条件下显示出EGFR显著诱导，作者推测EGFR可能在HIF-1结合区包含一个或多个单核苷酸变异(SNV)，于是作者从10个细胞系中分离DNA, Sanger测序并扩增了含有HIF-DNA结合位点的400 bp的EGFR区域，发现有三株细胞的有一个共同的点突变（T >C），采用荧光素酶报告实验检测得到，插入的HIF结合的位点的序列以及包含EGFR的单核苷酸(T >C)突变体，在缺氧条件下荧光素酶活性显著增强，而包含有三个HIF位点突变体对荧光素酶活性没有影响（Fig.3C-D）。以上结果说明缺氧条件下HIF-1α特异性募集到EGFR基因的内含子18与EGFR直接结合，单核苷酸突变未能影响两者之间的结合，进而无法影响EGFR的表达。

四、EGFR中的HIF结合位点改变了乳腺癌细胞系的甲基化模式

上述结果说明单个核苷酸的突变并不能影响乳腺癌细胞系在缺氧条件下诱导EGFR的表达情况，考虑到启动子区域的甲基化是基因沉默的影响因素，作者质疑ACGTG结合位点的甲基化状态是否在其中发挥了作用。

为了评估EFGR启动子HIF-1α结合区的甲基化状态，作者提取了MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1、HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231等乳腺癌细胞的DNA，亚硫酸盐处理后，PCR扩增了约400bp的包含HIF-DNA结合位点片段，并进行Sanger测序。测序结果（Fig.4B）显示MCF7、HCC1428、BT474、CAMA1细胞在HIF-DNA结合区未出现易发生DNA甲基化的位点，而HTERT-HME、MCF-10A、HCC1806、BT-20、SUM159、MDA-MB-231细胞存在较多的可能发生DNA甲基化的ACGTG位点。同时色谱分析亦证实了上述结果（补充资料）。接下来作者用甲基化特异性PCR（MS-PCR）和高分辨率熔解曲线分析（HRM）两种方法验证了Sanger测序的结果（Fig.4C-D）。同时，为了确定HIF-1α结合位点是否在正常的乳腺上皮细胞中被甲基化，作者用MS-PCR方法检测了4个不同个体的乳腺组织的细胞，发现它们是100%甲基化的（Fig.4E）。接下来作者在TCGA的数据中分析了探针cg20062492数据，以检测感兴趣的EGFR区域的甲基化状态。结果表明，与乳腺癌组织相比，正常乳腺组织在EGFR-HIF-1α高频结合区域的甲基化水平较高（Fig.4F）。

综合上述几个结果说明，HIF-1α结合位点的甲基化阻止了缺氧条件下的EGFR的表达。

五、EGFR的HIF结合位点的去甲基化在缺氧条件下恢复了EGFR的诱导

既然HIF-1α结合位点的甲基化阻止了缺氧条件下的EGFR的表达，那么去甲基化后是否能在低氧条件下恢复EGFR表达呢？作者用500nM azacytidine（AZA）或100nMDAC（脱氧胞嘧啶）处理MDA-MB-231和SUM-159细胞3天，然后再停药培养6天或10天。MSP-PCR结果显示AZA和DAC都使该位点的甲基化降低了80%（Fig.5A-B）。ChIP分析证实在缺氧条件下DAC的处理可增强HIF-1α（非HIF-2α）绑定到EGFR的HRE的能力（Fig.5C-D）。QPCR和WB实验亦证实缺氧条件下，AZA或DAC治疗8或10d后MDA-MB-231细胞中EGFR mRNA和蛋白的表达水平得到了恢复（Fig.5E-H）。

六、缺氧细胞对EGFR抑制剂敏感性检测

有文献报道有丝分裂的激活可刺激Ras/MEK/ERK和Ras/PI3K/AKT通路，从而诱导细胞周期蛋白cyclins、c-myc和Rb的磷酸化。作者通过WB检测发现，缺氧、EGF或EGF和缺氧结合可导致几乎所有细胞周期蛋白水平升高，Rb磷酸化增强，E2F1水平增强，但是p21水平降低（Fig.6A）。而在HIF-1α敲除细胞系中，cyclinD1、c-myc和Rb的磷酸化表达降低（补充材料）。

接下来作者研究缺氧诱导EGFR能否促进细胞周期的进展。EGF刺激MCF-7细胞0、24或48小时后，Ki-67染色发现EGF导致了缺氧条件下Ki-67表达的显著增加（Fig.6C and D），同时伴随细胞增殖加快（Fig.6E）。流式周期检测亦发现，EGF的刺激导致在缺氧条件下培养的S相细胞数量增加了21%，而在正常氧气条件下培养的S期细胞数量仅增加了12%（补充材料）。

鉴于上述结果，作者进一步地推断暴露于缺氧下的细胞是否对EGFR抑制剂（吉非替尼和厄洛替尼）更敏感。BT474用不同浓度的吉非替尼处理后，结晶紫染色实验发现，在缺氧条件下，BT474细胞对吉非替尼敏感性增强（Fig.6G）。而AlamarBlue染色实验证实，敲除HIF-1α后的MCF7细胞，在缺氧条件下对吉非替尼的耐药性增强（Fig.6H）。

最后，作者还研究了EGF刺激和缺氧对细胞运动性的影响。延时显微镜监测数据表明，暴露于缺氧条件下的BT474在EGF刺激下运动性增加最高（Fig.6I-K）。

综合以上结果说明，在缺氧条件下，HIF-1α诱导增强EGFR表达，激活下游信号通路，促进细胞增殖和运动，亦可增强细胞对EGFR抑制剂的敏感性。

分析了该文献的实验结果后，我们再来捋一下思路：

缺氧条件下，作者在前期结果中选择EGFR进行研究，在多株乳腺癌中发现其过表达，然后通过一系列实验排除了ER、核苷酸突变等对EGFR表达的影响，确定EGFR表达影响受其HIF-1α结合区域的甲基化调控，其HIF-1α结合区域的甲基化程度高，EGFR表达降低，其甲基化程度低，则EGFR表达增高，最后通过生物学实验证实，缺氧条件下EGFR表达增高的乳腺癌细胞对EGFR抑制剂更加敏感。从图片来看，感觉工作量不大，但实际作者做了大量的前期工作以及非常多的补充实验，而且设计严谨，逻辑紧密，并且为肿瘤应用的指导提供了建设性的意见，是一篇不错的研究。

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