辅助噬菌体扩增滴度偏低，噬菌体筛选阳性率下降。

第一个问题：

本人用的是M13K07辅助噬菌体，发现扩增后的辅助噬菌体，测滴度极其不稳定。滴度经常在10次方左右（8，9次方也经常不成比例），有时涂布盖上TG1后，长出来的噬菌斑也是惨不忍睹很小，不仔细看就看不见那种。

M13K07辅助噬菌体扩增方法

1) 将辅助噬菌体 M13K07 进行稀释涂布于 2×YT 琼脂平板上；

2) 制备 2×YT 半固体琼脂（ 0.7％琼脂）为上层琼脂（ Top Agar），冷却至 50 ℃时，

取 4 mL Top Agar 并加入 0.5 mL 过夜培养的新鲜 TG1 菌（ 12h过夜）， 充分混匀，

平铺至平板上。

3) 37℃培养 6-12 小时，用接种针挑取单个噬菌斑，接种于 50mL 2×YT-K

（ kanamycin 70 μg/mL）， 37℃充分振荡培养 14 小时；

4) 8000 rpm 离心 15 min， 4 ℃；

5) 小心取上清，建议用 0.45μm 滤膜过滤后4°C存放。

PBS稀释扩增后的辅助噬菌体从7次方——10次方（1ml），然后从稀释好的辅助噬菌体中取100μl+OD=1的TG1 900μl，37°C，250rpm 40min，结束后每个梯度取100μl涂板。

37°C，培养过夜，14小时

结果经常长不出。

第二个问题

在筛选过程中，0.1%TBST洗脱后，用PCR菌落鉴定90%等找到目的条带，到第二次0.2%TBST洗脱后发现目的条带就变成60%，50%了，是筛选有问题么，还是扩增有问题哦。我人都快傻了。有那位大佬能帮忙看看不。球球了