表观遗传RNA甲基化

Hello~everybody~~~又到文献分享的时间啦！想我了吗~

今天，我们继续着眼于国自然热点-表观遗传调控相关的文献，主题方向是RNA甲基化。

那什么是RNA甲基化呢？

RNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，RNA的甲基腺嘌呤被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象，主要形式为m6A甲基化。m6A甲基化修饰是可逆化的，包括甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化阅读蛋白（Readers）等共同参与。与人类的发育，免疫，肿瘤生成和转移，干细胞更新，脂肪分化等过程息息相关，因此，RNA甲基化已成为科研中一个重要且热门的研究方向。

接着，我们来了解下RNA甲基化现在的研究行情~~

先从pubmed分析一下RNA甲基化这一热点问题的研究情况吧！在pubmed数据库中输入“RNA Methylation”，文章数量为44095篇，并在近10年来研究势头居高不下。

从国自然立项情况来看，近十年来，立项项目的数目也一直在稳步增长的状态。

既然m6A甲基化热度不减。

那么，究竟如何检测m6A？

整体思路如何设计？

我们跟着今天介绍的这篇SCI一起来学习学习吧。

文献题目是：Methyl CpG binding protein 2 promotes colorectal cancer metastasis by regulating N6-methyladenosine methylation through methyltransferase-like 14. 影响因子6.711分，刚刚热乎乎的发表在Cancer science杂志上。主要研究MeCP2与甲基转移酶14（METTL14）结合，通过改变m6A甲基化修饰来调节肿瘤抑制因子KLF4的表达，进而影响结直肠癌的进展。

接下来我们跟着作者的思路一起来看看吧!

一、MeCP2基因在结直肠癌（CRC）临床样本中的研究。

作者首先用WB和IHC方法发现了MeCP2蛋白在癌旁组织中的表达显著高于癌旁组织（Figure 1A - 1C），同时MeCP2 mRNA表达的升高与预后较差相关（Figure 1D），TCGA数据总生存率分析亦显示高MeCP2表达与预后较差呈正相关（Figure 1E）。以上结果说明：CRC肿瘤样本中MeCP2表达增加，与预后差相关，MeCP2可能是CRC的致癌基因。

二、MeCP2促进CRC的转移、减弱CRC细胞的m6A水平

为了进一步确定MeCP2在CRC中的生物学作用，作者在HT29、HCT8和SW620细胞中敲低了MeCP2基因（Figure 2A and 2B），HCT116、RKO、DLD1细胞中过表达MeCP2基因（Figure 2E and 2F）。Transwell实验发现，敲低MeCP2后，细胞的侵袭和迁移能力显著降低（Figure 2C and 2D），相反，过表达MeCP2后，细胞的侵袭和迁移能力显著提高（Figure 2G and 2H）。m6A斑点实验和免疫组化实验显示敲低MeCP2基因后细胞m6A整体水平显著上调（Figure 2I and 2J）。相反，过表达MeCP2后，细胞整体m6A水平显著下调（Figure 2K and 2L）。综上，MeCP2抑制CRC细胞的m6A水平。

三、MeCP2与m6A甲基转移酶METTL14相互作用

既然MeCP2与m6A有关，那么是哪一个m6A相关的基因与其存在相互作用呢？作者的COIP和WB实验发现MeCP2仅与METTL14存在相互作用，而与其他m6A相关酶无互作（Figure 3A -3D）。但是MeCP2、METTL14和METTL3之间存在比较复杂的相互作用（Figure 3E）。之后WB实验证实，在293细胞中，METTL14截断蛋白与MeCP2和METTL3相互作用的较低（Figure 3F）。

作为一种内在紊乱的蛋白，MeCP2不能形成稳定的二级结构。作者猜测，这是这种结构的灵活性使MeCP2能够与METTL14相互作用。而接下来的免疫荧光实验发现显示MeCP2和METTL14在细胞核内重合（Figure 3G）。同时，MeCP2的过表达影响METTL3的蛋白表达水平，但是却不影响其转录水平的表达（Figure 3H and 3I）。

综上，这些结果有力地证实了MeCP2对RNA甲基化的影响依赖于MeCP2和METTL14之间的相互作用。

四、METTL14抑制CRC的转移

有研究表明，METTL14可以抑制结肠直肠癌的肿瘤转移。故，作者重点研究METTL14在CRC进展和肿瘤发生中的作用。首先，TCGA数据总体生存率分析发现低METTL14的表达与预后较差有关（Figure 4A）。在HCT116和RKO细胞中稳定敲低METTL14后，MeCP2的蛋白和mRNA水平并没有明显的改变（Figure 4B - 4D），而METTL3的蛋白水平显著降低（Figure 4B and 4C）。Transwell实验证实METTL14沉默促进了CRC细胞的迁移和侵袭（Figure 4E and 4F）。m6A斑点实验和免疫组化实验表明，METTL14的敲低显著降低了细胞的整体m6A水平（Figure 4G and 4H）。以上研究表明，METTL14作为一种肿瘤抑制剂抑制CRC的进展和肿瘤的发生。

五、m6A甲基化的方式调节KLF4的表达

为探讨MeCP2和METTL14的潜在调控靶目标，作者将敲低METTL14的HCT116细胞中和敲低MeCP2的HT29细胞进行RNA-Seq（Figure 5A），在METTL14敲低的HCT116细胞筛选出600个上调或下调的基因，而在MeCP2敲低的HT29细胞中筛选出2297个上调或下调基因（Figure 5B）。一共有32个基因在METTL14敲低细胞中表达下调，而在MeCP2敲低的细胞中表达上调，44个基因在在METTL14敲低细胞中表达上调，而在MeCP2敲低的细胞中表达下调（Figure 5A）。接下来，作者对这76个基因进行了GO富集分析（Figure 5C and 5D），并用RT-qPCR回复验证了生信分析的结果（Figure 5E）。

鉴于KLF4对癌有显著的抗肿瘤作用，特别是在CRC中，因此作者选择KLF4作为进一步研究的共同靶点。敲低METTL14或过表达MeCP2导致KLF4的蛋白水平、mRNA水平及m6A甲基化水平下调，而敲低MeCP2得到相反的结论（Figure 5F and 5H）。Transwell实验表明，KLF4过表达可抑制CRC的侵袭和迁移能力，相反其敲低促进了CRC细胞的侵袭的迁移能力（Figure 5K and 5L）。

综上这些结果说明：MeCP2和METTL14以m6A甲基化相关的方式调节了KLF4的表达，进一步促进了CRC的进展和肿瘤的发生。

六、MeCP2在体内和体外通过METTL14介导的抗肿瘤转移促进CRC的转移

前面的实验证实MeCP2和METTL14存在相互作用，接下来作者探究二者的相互作用对体内外功能的影响。Transwell实验发现METTL14的敲低消除了因MeCP2过表达对CRC细胞迁移和侵袭的促进作用（Figure 6B）。裸鼠成瘤实验显示MeCP2过表达和METTL14敲低比显示出较多的促转移信号（Figure 6C）。手术解剖后发现，这两组裸鼠的肝脏中转移结比对照组多（Figure 6D and 6E）。HE染色实验亦证实，与对照组相比，MeCP2过表达和METTL14敲除组小鼠肝转移病灶更多更大（Figure 6F）。同时，在小鼠肝脏和临床CRC组织的IHC实验证实高表达MeCP2的临床癌组织样本同时低表达METTL14或KLF4（Figure 6F- 6G）。综上结果说明MeCP2可能被认为是一种促转移基因，而METTL14可能是一种抗转移基因。

七、MeCP2和METTL14通过IGF2BP2依赖的m6A修饰增强KLF4 mRNA的稳定性

m6A甲基化修饰后的“reader”蛋白决定修饰后的mRNA的稳定性或蛋白质翻译的效率，IGF2BPs作为一个RNA结合蛋白家族，主要起抑制mRNA衰变的作用。但IGF2BPs是否能调节m6A甲基化修饰的KLF4 mRNA稳定性暂未见文献报道。作者发现METTL14的敲低或MeCP2的过表达显著降低KLF4 mRNA的稳定性，而MeCP2的敲低则增强其稳定性（Figure 7A）。将KLF4潜在的m6A修饰位点进行突变，构建两个具有MUT-1和MUT-2突变基序的荧光素酶载体。与野生型相比，MUT-1显著降低了双荧光素酶活性。同时，METTL14的敲低和MeCP2的过表达显著降低了荧光素酶活性，而MeCP2的敲低增强了荧光素酶活性（Figure 7C）。有意思的是，具有m6A甲基化修饰位点的MUT-2呈现出了与野生型类似的荧光素酶活性（Figure 7C）。此外，MUT-1组（MeCP2过表达和METTL14敲低）对IGF2BPs调节的影响显著缩小（Figure 7C）。上述结果表明，KLF4 m6A甲基化结合位点完全由METTL14和MeCP2精确调控。

为了确定IGF2BPs家族哪一个成员调节参与了调控了KLF4 m6A甲基化，作者设计了跨越部分HA标记序列的特异性引物。RNA免疫沉淀（RIP-qPCR）表明，IGF2BP2和IGF2BP3都可以与KLF4 mRNA结合，但只有IGF2BP2能够明确识别KLF4 mRNA中的m6A甲基化位点（Figure 7D and 7F）。同时，RT-qPCR实验发现HT29和HCT116细胞中IGF2BP1基因的表达极低（Figure 7E）。

综上结果说明MeCP2和METTL14通过IGF2BP2依赖的m6A修饰增强KLF4 mRNA的稳定性。

综上，文章解读全部完毕，现在我们来重新捋一遍文章的思路。

第一步，作者找到了在CRC中高表达，与预后不良有关MeCP2基因。证实其促进CRC的迁移和侵袭、减弱整体m6A水平。

第二步，找到互作靶基因-METTL14。发现METTL14抑制CRC的迁移和侵袭，其敲低减弱整体m6A水平，二者存在负调控关系。

第三步，研究MeCP2/METTL14的下游靶基因KLF4。发现MeCP2/METTL14通过m6A修饰影响KLF4 mRNA的稳定性，

最后，做了一个小小的提升，发现KLF4 mRNA的稳定性与m6A“reader”蛋白IGF2BP2相关。

如果还未完全理解，看看我们的模型图（Figure 7G）吧，清晰地展示了MeCP2和METTL14以m6A甲基化修饰依赖方式通过IGF2BP2参与KLF4的调控机制。

总结得非常好！

回味一下，这篇6分多的文章也不是那么复杂，仅涉及斑点实验、Me-PCR这两个与m6A相关的研究方法。本月的第二篇文献仍与m6A相关哦，影响因子就翻倍了，会涉及更多的检测m6A的方法哦。

如果想知道更多的关于表观遗传之RNA甲基化的相关文献和知识点，以及专属实验方法记得点个关注哦~小编一定会勤勤恳恳认真更新滴

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