胎鼠大脑皮层神经元分离培养教程

神经元培养主要分为以下几步：取材选择、材料及试剂选择、爬片处理、取材、分离、培养、要点总结，接下来具体围绕这些来说

1、取材选择

一般来说取即将出生的胎鼠或者出生三天之内，最好两天之内的胎鼠，分离效率高，细胞存活率也高，胎鼠的话一般你就能看到母鼠的肚子比较大了，感觉差不多两天之内就能生的样子，这时候就可以了

2、材料及试剂选择

材料包括培养皿、培养板、爬片、取材器械、分离时使用的离心管、三个左右的冰袋等

试剂包括解剖液、种板液、培养液、B27、谷氨酰胺、PDL、硼酸钠缓冲液、木瓜酶、DNA酶

我们使用的全部试剂和材料都是国外的，只有实验员是本地的，切记

爬片和PDL的选择很重要，相当重要，超级无敌重要，这一步处理不好细胞就不会贴壁或者直接抱团生长，根本无法用于实验

除爬片外的其他材料，一般来说实验室常用的都是可以的

试剂：解剖液可以使用高糖的DMEM基础培养基，这个是没问题的，种板液可以使用高糖的DMEM完全培养基，培养液使用的是GIBCO 无血清培养基neurobasal，配制是48.5mlNB+0.5ml谷氨酰胺+1mlB27，试剂都是使用GIBCO公司的

木瓜酶的浓度建议0.06mg/ml，DNA酶浓度为0.1mg/ml,这两个都是配制好的浓度，我的使用习惯是5ml木瓜酶+1mlDNA酶，用于五只胎鼠的皮层，十只用量就乘2

3、爬片处理

玻片买回来，浓盐酸浸泡，摇床80转过夜，蒸馏水冲洗十遍往上，洗净盐酸，75%酒精浸泡10h以上，置于无水乙醇中备用（为什么要置于无水乙醇中，因为爬片拿出来后乙醇都自己挥发了，可以直接包被，很方便），PDL(使用0.1M/L的硼酸钠缓冲液配制）玻片包被浓度为0.1mg/ml，板子瓶子为0.01mg/ml,包被过夜，无菌水洗四遍（注意，是水，而不是PBS）备用

4、取材

提前准备4个大点的培养皿，装好解剖液置于冰袋上备用，挑选好的母鼠，脱颈处死，浸泡于75%酒精2min消毒，取胎鼠，胎鼠喷酒精消毒，断头，放入提前准备好的皿中快速摇晃清洗一遍，再在另一个皿中再清洗一遍，目的是洗净血水，放入第三个皿中，开颅取脑置于第四个皿中，皿都在冰上

在体视显微镜下，分离皮层，去净血膜和血点，（根据实验目的自行分析是否需要去掉海马区)，这一步也在冰上

从断头取脑开始，一直到去净血膜和血点，一定要快，越快越好

5、分离

处理好的皮层组织，用大的巴氏吸管吸取到2ml离心管中，两分钟内贴着冰袋充分剪碎到1立方毫米大小，开始消化，5ml木瓜酶+1mlDNA酶置于培养箱消化7min＋7min，中间拿出来轻柔吹打三五下混匀，助于消化（从头到尾所有的吹打部分都用巴氏吸管，口径大，对细胞损伤小，吹吸一次的时间控制在十秒这个速度），消化完成加入血清终止消化

消化好后使用一次性的筛网（40um）过滤一次，滤液移到15ml离心管中，1000转5min离心（最大转速不要超过500g），加入预热好的种板液重悬，再次离心，重悬种板

6、培养

种板时间为4h，种板密度为12孔板50万/孔，6孔板100万/孔，种板过程中要保持细胞悬液的浓度均匀，4h后全量换液，换成NB培养液，12孔板1ml培养基，6孔板2ml，培养三天后，每次换液为半量换液，换液时切记枪头贴壁缓慢加液。