温故知新，色谱分析中的那些“Volume”

在色谱资料中经常会看到 Void Volume、dead volume、Dwell volume 这些词，相信不少人会有些雾里看花的感觉，感觉上也知道是什么意思，但是如果深究又有点模糊。本文整理了一些资料，汇总分析，希望能够比较全面的对这些词及所含的意义有一个深入的认识。

当然，因为理解及能力所限，只当是抛砖引玉，以供讨论了。

对于色谱柱而言

有过色谱柱使用经历的人应该经常会见到以下两句话：

Equilibrate the column by passing approximately 10-30column volumes of mobile phase at normal flow rate.

用大约10-30倍柱体积的流动相在正常流速下平衡色谱柱。

Flush with 10-30 column volumes of mobile phase without buffer to remove any buffers or salts.

用大约10-30倍柱体积的无缓冲盐流动相冲洗色谱柱，以除去缓冲盐。

这里面就涉及到了柱体积（column volumes），那么什么是柱体积，该如何获知或计算呢？

可能有人说色谱柱不就是一根圆柱不锈钢管子吗？直接按照圆柱体积公式 V=πr2h 进行计算不就行了。当然，以这种方式计算后，按照色谱柱使用说明采用相应倍数的柱体积去操作肯定没有问题，能够满足平衡或者冲洗的要求。

但根据所调研的一些相关资料显示，色谱柱的柱体积计算可能没有这么简单，以下简单介绍供参考。

对于色谱柱而言，柱体积（column volumes）、死体积（dead volume）、滞后体积（Dwell volume）均指色谱柱的空隙体积（void volume of a column），只是不同说法的同一个意思，一般均指不保留物质通过色谱柱的时间与流速乘积。简单而言，这个空隙体积等于柱管体积减去填料颗粒所占据的体积。比如，图1所示，色谱柱就是一根圆柱形管子装满了硅胶颗粒。

图1 色谱柱简示图

因此，该体积的计算分为两部分，柱管体积（一般为不锈钢管）和填料颗粒体积。

一般而言，可以把色谱柱看成一根标准圆柱（图1），那么对于其体积的计算可以根据柱子规格（比如4.6mm × 250mm ）,按照圆柱体积公式V=πr2h进行计算而得：4152.65 mm3 (π × 2.3 mm × 2.3 mm × 250 mm），即4.15265ml。

填料颗粒体积可能因为不同的填料类型及颗粒大小而有所差异，大多情况下可能不是那么容易获知。但如果只是大致的估计，一般而言填料颗粒所占体积比例约为60%。对于安捷伦色谱柱而言，大多数情况下，有一个比较简单快捷的计算规则：对于内径为4.6mm的色谱柱，所占体积约为0.5ml/50mm，对于内径为2.1mm的色谱柱，所占体积约为0.1ml/50mm。

按照上述的计算方式，即可得知色谱柱的柱体积。以规格为4.6 × 150 mm的色谱柱为例：

柱体积=柱管体积（π × 2.3 mm × 2.3 mm × 150 mm≈2.5ml）-填料颗粒体积（0.5ml/50mm×150mm=1.5ml）≈1.0ml。

当然还有一些其他的计算方式，比如中国药科大学色谱分析课程中所介绍死时间（tM）的计算：

图2 tM的计算（来源于网络）

其实，面对当前种类繁多的填料颗粒技术以及复杂的使用条件，对于上述的计算可能存在一定的估计值或者困难。对于我们日常使用而言，不如简单处理，直接按照V=πr²h计算，对于我们的色谱柱使用基本不会存在什么问题，只是比理论稍微耗时而已。但是，多平衡一会儿或者多冲洗一段时间，对很多人来说可能更安心。

对于HPLC系统而言

在HPLC系统中，可能有人会将“dwell volume”与“dead volume”弄混淆，其实二者有不同的定义，对我们的使用意义也大为不同。

对于HPLC的梯度分析，我们经常会关注HPLC系统的“dwell volume”，也叫梯度延迟时间（gradient delay volume），尤其是在不同实验室、不同仪器之间做方法转移时。其实，此处的“dwell volume”也是一个“Void Volume”，但却不同于色谱柱的“Void Volume”。对于HPLC系统而言，“dwell volume”是指从泵或混合器（因不同仪器而异）开始至柱头的体积，不包括色谱柱的“Void Volume”。

而HPLC系统中还有另外一个名词“dead volume”，即死体积，一般是指由进样器开始到检测器流通池的体积总和。主要包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、色谱柱内固定相颗粒间隙占据的体积、柱出口管路体积、检测器流通池体积。

“dwell volume”对于我们的方法转移比较重要（等度洗脱不受影响），会影响分析方法保留时间或分离的重现性。在欧洲药典的分析方法中有时会载明色谱柱的填料、规格等信息，我们在重现方法时发现不能完全符合载明的保留时间或分离效果，甚至采用了推荐的色谱柱也无法完全重现。此时可能就是“dwell volume”的原因。因此，EP在推荐色谱柱的同时，有的还会载明“dwell volume”以便方法的确认。

欧洲药典“2.2.46. Chromatographic separation techniques”中提供了“dwell volume”的详细测定方法（此处不再赘述），我们可以参照测定，并根据方法确认情况加以调整。

结语

本文对Column Volume、Void Volume、dead volume、Dwell volume这些概念进行了简单的分类、对比梳理，因能力所限，不敢说完全无误，只希望对曾经有些模糊的认知提供一些理解上的启发。

作者： FADED