enzyme immunoassay(EIA)免疫酶测定法

概述

酶免疫分析( Enzyme immunoassay,EIA)是一种将酶的催化放大作用与抗原抗体免疫反应的特异性相结合的微量分析技术。用酶标记的抗原或抗体与样品中待测抗原或抗体发生免疫反应后生成有酶标记的抗原抗体复合物,然后在反映液中加入底物,酶催化底物水解显色,由于颜色变化可放大酶量的变化,因此通过测定吸光度的改变可计算出待测抗原或抗体的浓度。

酶免疫分析的技术进步

近年来,EIA技术取得了显著的发展,主要表现在以下方面:

1.继单克隆抗体后的第三代抗体基因工程抗体的应用,明显地提高了检测的特异性,基本消除了抗原、抗体间的非特异性交叉反应,保证了分析的准确性。抗体制备技术的进步,使试剂的生产制备得以规模化,检测范围日益扩展,小分子抗原、半抗原的检测成为事实。

2.分析方式的改进与多样化提高了试验的敏感性

(1)除早期的竞争法,间接法外,又发展了双抗原夹心法测抗体,偶联酶标记法测抗原,桥联酶免疫分析,酹放大免疫分析技术等,后者应用了生物素-亲和素系统,底物循环放大系统,酶-抗酶放大系统及酶偶联放大系统等。

(2)由于酶标记技术的进步,标记酶的应用已从过氧化物酶,扩展到碱性磷酸酶,β半乳糖苷酶,尿素酶,葡萄糖6磷酸脱氢酶,葡萄糖氧化酶,苹果酸脱氢酶,至今有二十多种酶被应用于EIA,但应用最多的仍然是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。

(3)酶免疫分析与其它标记免疫分析相结合如与荧光免疫分析(结合形成荧光酶免疫分析,酶促放大时间分辨荧光免疫分析,EIA与化学发光免疫分析结合形成酶一化学发光免疫分析,增强化学发光酶免疫分析( ECLEIA)。EIA与聚合酶链反应结合形成的 PCR-EIA分析等。

(4)分析方法的创新如同步 ELISA法测定多种抗体是将抗原包被在与微孔相匹配的钉板的钉子上,盖上钉板的同时与微孔内的所需标本、试剂反应,是又一种改良 ELISA利用抗体和抗抗体能形成多层复合物的特性,将常规二步温育法改为一步温育测定法,使检测时间大为缩短,现在已广为应用。

酶免疫分析技术的自动化

20世纪50年代生化自动分析仪就取得实际应用。由于酶免疫测定技术上的特殊性,直到20世纪80年代后才有自动化分析系统问世,目前我国全自动酶标仪市场基本上被进口品牌独占天下。按分析过程的不同,酶免疫测定可分为均相和异相两大类。

1.均相酶免疫测定及其自动化

均相酶免疫测定也称非固相或液相免疫测定,用于小分子物质特别是药物浓度的测定。模式为竞争法,即标记的抗原与标本中的抗原竞争结合特异性抗体,然后进行标记物的测定。在特定的情况下,与抗体结合的标记物失去其特性,因此不需将结合的(B)和游离的(F)分离即可直接测定F中标记物的量。

2.异相免疫测定及其自动化

大部分标记免疫测定均属异相。最常用的B和F的分离手段为固相载体的洗涤,但在临床化学测定中无此步骤。70年代初, Engvall和 Perlaman等学者首次创建非均相酶免疫测定技术,也称固相酶免疫测定即酶联免疫吸附剂测定,通用的名称为ELISA,在 ELISA中通常用聚苯乙烯为固相载体,有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等类型。不同形式的固相载体要求不同的洗涤装置。因此异相免疫测定的自动化不能借助于生化自动分析仪,各种方法均有其特殊的自动分析系统。

酶免疫分析的局限性

1.酶免疫分析检测的特异性实际上决定于单克隆抗体所针对的抗原决定簇。因而受试剂中包被所用抗原抗体的纯度、特异性,酶标记物的稳定性、特异性、纯度、亲和力以及制备工艺等诸多因素的影响,故对检测试剂盒应严格比较和选定。固然,其他标记免疫分析方法也有此类问题,但EIA试剂盒的供应厂商数量最多,应予注意。

2.在酶免疫分析测定结果中目前所测的胰岛素或C肽,近年发现是该物质及其前体的混合物就是受抗体局限的明显例子,是由于有交叉的抗原性而难以分开,因此通常检测的只能称为“免疫反应性”胰岛素或C肽,这使得我们需重新评价过去对所测的胰岛素或C肽的认识,并致力于“真”或“纯”胰岛素、C肽的测定,类似的情况可能还会发现。

3.酶免疫分析以固相反应为主,在测定中要注意克服固相不同部位包被抗原(抗体)量不一致引起的表面效应,温育时要防止边缘孔与中心孔反应条件不一致引起的边缘效应,以及抗原、抗体间比例不匹配可能引起的钩状效应,必须引起注意的是操作简易的“一步法”常比“二步法”易发生钩状效应。

4.固相材料存在非特异性吸附,标本溶血或冰箱贮存可释放过氧化物酶,冰箱贮存时间过长可导致血清IgG聚合,均容易引起本底偏高,甚至严重干扰测定。需要指出的是随着技术进步和仪器自动化程度越来越高,这些缺陷在自动化程度较高的仪器和工作量较大的实验室中已不十分明显但在半自动化仪器和标本量少需冰箱贮存时,这些缺陷还是显而易见的。总之,随着科学发展和技术创新,酶免疫分析技术必将越来越完善,自动化程度越来越高,准确度和精密度越来越好,定将为人类的健康事业作岀更大的贡献。