HEK293细胞瞬转方案PEI法（欢迎交流）

产品名称 作用 规格 储存条件

KOP293 293细胞培养液 1000ml 2~8℃

KPM 转染缓冲液 100ml 2~8℃

TA-293 转染试剂 6ml -20℃

KE-293 293蛋白表达增强剂 6ml -20℃

KT-Feed* 瞬时转染营养添加剂 100ml 2~8℃

实验方法根据珠海恺瑞生物瞬时转染KOP293-Kit（293细胞重组蛋白表达系统）

1、将HEK-293细胞置于5%的CO2恒温摇床中（使用其它浓度的CO2可能会严重影响细胞培养效果），37℃、120rpm恒温震荡培养（具体转速可根据用户培养箱摇床种类及实际培养情况自行调节）。传代时，需先做细胞计数和观察细胞活率，尽量选择密度在3-6×106个/毫升的高活率细胞进行传代培养。过高培养密度的细胞在传代培养后有可能会出现生长速度缓慢、培养密度降低等生长状态的变化，并直接影响重组蛋白表达等后续应用效果。

2、传代培养时建议传代后的细胞密度为0.3×106个/毫升，一般每4天需传代1次（或传代密度为0.6×106个/毫升，每隔3天传代1次）。本培养液可支撑的最高细胞密度约为1.3×107个/毫升，细胞在达到此密度时存活率一般仍可保持在95%以上。

若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。

2.2转染细胞的准备

a.在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率。为确保转染效果，建议使用生长处于指数期（密度约为2~4×106个/毫升）、存活率大于98% 的细胞转染；

b.细胞无需离心，若细胞密度为2.0×106个/ml时，则可直接转染，若细胞密度>2.0×106个/ml，则需兑入新鲜的KOP293培养液，将细胞密度稀释成2×106个/毫升（客户也可根据自身经验摸索合适的转染密度）；

c.摇瓶置于5%的CO2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。

a.准备两支15ml无菌离心管，在其中一支中加入5ml KPM和100μg无菌质粒DNA，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5ml KPM和500μl TA-293转染试剂，轻轻吹打混匀；

b.将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；

室温下静置10分钟制备出质粒-载体复合物

从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养。

2.4产物表达与检测

a.转染24小时后可加入600 μl 293细胞蛋白表达增强剂（KE-293），以增加产物表达量；

b.瞬时转染营养添加剂(KT-Feed 50×)可提高产物的表达量，可在转染24小时后添加一次；

c.转染后第6天测定产物表达量；