humanized antibody人源化抗体

概述

人源化抗体是在嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源成分,及保留鼠抗体CDR区,其余全部替换成人抗体相应部分,这种经过改型抗体,人源成分达90%,即通常所指的人源化抗体。在疾病治疗中,人源化抗体之所以优于鼠源性抗体,不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应,还在于人源化抗体中FC段能够诱发机体的效应机能一募集效应因子或效应细胞,后者对靶细胞具有杀伤作用。

人源化抗体的表达

1.在大肠杆菌中表达

细菌是表达无糖基化蛋白的最理想工具,在所有细菌表达系统中,大肠杄菌表达系统被列为首选对象。但由于受其自身加工能力的限制,大肠杆菌不适合表达完整的抗体分子,大多用来选择性表达Fab或scFv等抗体片段。用大肠杆菌表达单链抗体有2种方式:一种是表达为包涵体或非包涵体的不可溶性蛋白,这种表达方式的产量较高,但须进行复杂的变性-复性过程,使其完成正确的空间结构折叠,恢复抗体活性;另一种是分泌表达,将细菌的信号肽与单链抗体的氨基端连接起来,细菌的信号肽可使单链抗体分子分泌到细菌的周质腔内,此时信号肽被信号肽酶切除,单链抗体分子在具有氧化环境的周质腔內完成二硫键的形成和肽链折叠,形成有活性的抗体分子,但产量较低。单链抗体在大肠杆菌中的表达对启动子无特殊要求。在分泌型表达时,需要有适当的信号肽序列,有适当的内切酶位点来拼接单抗基因。

2.在酵母中表达

自20世纪80年代初 Hitizeman等首次运用酿酒酵母表达了人干扰素基因以来,运用酵母这种单细胞真核生物表达外源基因越来越受到重视,已建成了多种基因表达系统,表达出了多种蛋白质。巴斯德毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以用于细胞内表达外源基因的个理想的酵母表达系统,它具有强启动子AOX1、完善的分子生物学操作方法、成熟的高密度发酵技术,已成为生产商业化蛋白的重要表达系统之一。利用强启动子AOX1已经高效表达了多种外源基因,如肿瘤坏死因子、人血清白蛋白、蛋白酶抑制因子等都超过1g的表达水平,其中肿瘤坯死因子和破伤风毒素C片段的表达水平达10g/L以上。多形汉逊酵母是又一个成功的酵母表达系统,已用于表达乙型肝炎表面抗原等用它可以开发一种新的低廉的乙肝疫苗。

3.在哺乳动物细胞中表达

与原核细胞、酵母、细菌及昆虫细胞相比,以哺乳动物培养细胞作为宿主细胞,表达的蛋白最接近其天然构象,因而哺乳动物细胞表达系统成为生物工程制药较为理想的表达系统。在使用哺乳动物培养细胞表达抗体时,在蛋白合成起始信号、加工、分泌糖基化方面具有独特的优势,因此,大多数研究者都采用哺乳动物细胞进行重组抗体的表达。最基本的真核表达组件包含可转录外源DNA序列的启动子元件和转录产物有效地加上ploy(A)所必需的信号,另外一些附加元件包括增强子及带有剪接供体和剪接受体功能位点的内含子。常用的表达载体有pSV2-gpt和 pSVneo因其带有选择标记基因( gpt,neo),可以筛选到稳定表达人源化抗体的克隆,并通过加工筛选,使其表达量有较大的提高。许多研究结果显示,COS细胞是短暂高效表达人源化抗体较为理想的细胞,一般在几天内即可以装配成功,避免花费不必要的时间去构建稳定的细胞系,从而为快速分析抗体提供了可能。

人源化抗体在医学领域的应用

1.医学诊断

实验诊断抗体是实验诊断学领域用途最为广泛的蛋白分子。噬菌体抗体完全可以代替动物源性抗体,应用于免疫学诊断。此外还可以通过融合表达方式,直接生产抗体-酶,抗体荧光蛋白,抗体生物素等标记抗体,避免了化学标记对抗体活性的损伤;肿瘤放射免疫显像诊断放射性核素(125I、99Tcm、131I）与抗肿瘤抗体的偶联物在体內能将前者运至药靶部位,并通过放射免疫显像技术用于体內肿瘤定位诊断。双特异性抗体(BsAb）为放射免疫显像提供了一种更为有效的手段,可减轻药物对机体的损伤,并增加放射免疫显像的清晰度和灵敏度。

2.疾病治疗

作用机制:特异性抗体在病毒感染早期和从感染靶细胞释放出病毒时期是重要的防御屏障,因为在此期间,病毒处于细胞之外,抗体可与之结合,抗体主要通过下列途径发挥作用。①中和:与病原体的表面抗原相结合,阻止它们进入易感细胞和组织。②调理作用:与病毒结合后,可促进吞噬细胞对病毒颗粒的吞噬作用。③补体激活:通过抗原-抗体复合物或病原体抗体复合物激活补体诱导炎症反应,并吸引吞噬细胞进入感染位点;另一方面,通过经典途径和旁路激活途径形成攻膜复合体,最终导致感染细胞的裂解。④抗体依赖性的细胞介导的溶细胞效应(ADCC):单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞通过其表面分子FcγR与抗体分子的Fc段相结合,从而结合在感染细胞的表面:发挥杀伤作用。