氢-氘交换和共价标记质谱法对应激抗体的补充结构信息

大家好，本周为大家分享一篇发表在J. Am. Soc. Mass Spectrom.上的文章，Complementary Structural Information for Stressed Antibodies from Hydrogen–Deuterium Exchangeand Covalent Labeling Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是美国马萨诸塞大学的Richard W. Vachet。

单克隆抗体（mAb）市场在过去25年中增长迅速，越来越需要快速、有效地表征其高阶结构（HOS）的分析方法。与小分子不同，mAb结构复杂，并且由于处理或储存不当而导致的HOS变化可能导致稳定性降低，功效丧失或可能的免疫原性。因此，对于蛋白质—配体复合物（包括单克隆抗体）的结构深入认识，在评估HOS生物仿制药的开发中至关重要。

  传统的技术手段检测mAb HOS的变化可采用核磁共振（NMR）、X晶体衍射、荧光光谱法和圆二色谱法等，但受到样品量、分子量及异质蛋白等因素的限制，或者无法提供局部构象变化的特定信息。与其他结构表征技术相比，质谱（MS）作为蛋白质分析的强大工具，具有样品消耗量少，基本上没有分子量限制的优势，并且具有分析复杂蛋白质混合物的能力。MS作为表征蛋白质HOS的方法，采用氢-氘交换（HDX）的方法实现将蛋白质的结构信息编码到蛋白质的质量中；测量骨架酰胺氢与氘的交换，蛋白经酶解消化后，使用MS检测质量增加并定位到肽片段上。同样，采用共价标记（CL）修饰暴露于溶剂的氨基酸侧链，也可以用MS检测质量变化实现表征蛋白质HOS，并且该方法最近已经用于抗体的结构分析和表位—对位图谱绘制。HDX/MS和CL/MS互为补充，HDX提供蛋白质主链信息，CL报告侧链信息。CL试剂焦碳酸二乙酯（DEPC），可以在较慢的时间范围内（即秒）进行反应，可与亲核残基（包括Cys，Lys，His，Thr，Ser和Tyr）反应，可以与HDX/MS数据结合使用，为更深入的了解结合位点和结合诱导的结构或动力学变化提供依据。

  该团队使用利妥昔单抗作为模型系统，同时使用HDX/MS和基于DEPC的CL/MS提供有关热应激治疗性mAb的互补和协同HOS信息。具体流程为选择三种水平的热应力即热应激样品在水浴中在45、55和65°C孵育4 h以引起不同程度的结构变化，分别进行DEPC标记程序(包括共价标记、淬灭、胰蛋白酶水解消化、液相色谱/串联质谱（LC-MS/MS）分析、CID串联质谱图搜库)和HDX程序（包括交换反应、淬灭、蛋白水解消化、LC分离和MS条件、Waters DynamX 3.0软件计算），以比较这两种技术提供的信息，一起提供对热应激mAb中发生的结构变化的更全面了解。

在45°C下热应激4 h

  HDX和DEPC-CL可用于鉴定热应激后利妥昔单抗经历的任何HOS变化。利妥昔单抗的每个重链/轻链二聚体包含总共236个His、Lys、Tyr、Thr和Ser残基，可用DEPC标记。结果表明，该蛋白45°C下加热4小时再与DEPC反应后，有154个残基被标记，与未加热（即37°C）状态相比，只有17个残基的标记程度发生了显著变化，且17个残基分散在整个蛋白质中，未见聚集（图1A）。此外，这17个残基中的12个是Ser，Thr和Tyr，它们与DEPC的CL反应性受残基周围的微环境影响，表明反应性的变化主要归因于侧链的重新定向。至于其余五个发生变化的Lys和His残基中的大多数会增加标记水平，这是因为一些蛋白质分子会部分展开并具有增加的侧链溶剂可及性。但是，这些微小的结构变化不会在45°C加热和原始状态之间引起HDX的任何显着变化（图1B）。此外还发现用于HDX/MS分析的87种肽中有3种在应激和天然状态下均表现出两种交换分布，虽然表明溶液中至少存在两种不同的利妥昔单抗构象，但是这三种肽在45°C应激和天然条件下没有显示任何显着差异。总体而言，在45°C的热应激4小时后，利妥昔单抗的结构没有明显改变。

图1.热应激（45°C下4 h）利妥昔单抗的DEPC CL/MS和HDX/MS结果。（A）DEPC-CL变化情况。红色表示的残基表示CL程度升高，而蓝色表示的残基表示CL程度降低。显示了残基Ser158和Lys396的标记程度变化的代表性图。深灰色表示原始状态，而浅灰色表示热应激状态。变化分散在整个蛋白质中，没有聚类，这表明缺少大量的HOS变化。现有IgG1 Fab晶体结构（PDB 1FC2）和通用IgG1 Fc晶体结构（PDB 2IG2）的原子坐标用作模板以生成rituximab结构，并对铰链区进行了理论建模。然后使用分子可视化系统PyMOL将利妥昔单抗的Fc（PDB 4W4N）和Fab（PDB 4KAQ）结构与模板对齐。为了清楚起见，仅示出了一条轻链和一条重链上的CL。（B）在45°C加热后利妥昔单抗的HDX / MS图。未加热状态显示为黑色，而热应力状态显示为红色。没有观察到氘代的可测量差异。

在55°C下热应激4 h

  在将利妥昔单抗在55°C下加热4小时后，DEPC-CL的变化主要聚集在Fab区域，而散布的CL在Fc区域增加（图2 A）。236个可标记残基中有133个被标记，而31个标记程度发生了显著变化。和45°C的热应激结果一致，被标记的70％残基是Ser、Thr和Tyr，剩余的His和Lys残基都会发生标记水平增加（主要位于Fab和铰链区）。HDX/MS数据显示，蛋白质的148-171区域发生了氘代水平升高（图2 B）。此外，HDX数据发现， 80种肽中有8种具有两种交换分布，再次表明溶液中有两种构象。这些肽中的三个来自轻链的C末端，四个来自重链的C末端，一个来自CH1结构域的中间。但通过比较天然状态和55°C的应激状态，发现即使在55°C加热后这些区域中出现了新的蛋白质构象，HDX / MS也无法轻易分辨它们。

图2.热应激（55°C下4 h）利妥昔单抗的DEPC CL / MS和HDX / MS。（A）DEPC CL和HDX更改。红色表示的残基表示CL程度增加，而蓝色表示的残基CL程度减小。CL程度发生变化的残基聚集在Fab（用黑色虚线圈出）。显示了Lys226，Thr20和Ser407残基的CL/MS标记程度变化的代表性图。深灰色表示原始状态，而浅灰色表示热应力状态。在结构上以橙色突出显示的是经历增加的HDX的肽。图1的标题中显示了利妥昔单抗分子模型的详细信息。为了清楚起见，仅显示一条重链和一条轻链上的标签。（B）多肽148-171在55°C加热后，利妥昔单抗的HDX/MS图，其吸收发生显着变化。未加热状态为黑色，热应激状态为红色。（C）多肽353–368在55°C加热后，利妥昔单抗的HDX/MS图，其氘代水平没有显着变化。未加热状态为黑色，热应激状态为红色。如果肽段在所有时间点和所有肽段的所有差值的平均值之外3σ，则发现它们在统计学上是不同的。

在65°C下热应激4 h

  将利妥昔单抗在65°C加热4 h后，DEPC CL/MS和HDX/MS结果均出现明显的结构变化。对于22个残基，观察到CL程度的显著变化，并且发现六个肽的氘替换经历了显著变化。在22个残基中，CL的程度增加7个，减少15个，而HDX的6个肽中的2个增加而4个减少（图3）。值得注意的是，HDX程度增加的两种肽之一是在55°C加热时交换增加的同一肽（即肽148-171），这表明该部分蛋白质在加热后易于解折叠或动力学增强。

  另外，在HDX分析中考虑的128条肽段中有7种具有两个交换分布，表明存在多种构象。在显示多个构象的7条肽段中的2个，其缓慢交换的构象在加热后变得更加丰富，这与这些位点由于一部分蛋白质分子中的聚集而被掩埋相一致。Fab区的CL和氘的标记增加相对较少，而整个蛋白质的吸收量却有所减少（图3A和3B），这是由于在此温度下发生的蛋白质聚集，预期标记和交换减少的普遍性。

  尽管CL/MS和HDX/MS的结果基本一致，但对两种技术提供的信息进行比较可以得出：经历DEPC标记的残基位于HDX无覆盖、HDX无变化、与HDX相反的变化或与HDX相同的变化的区域内。经历CL变化的残基中有十五个区域的氘代水平没有变化，其中5个为分子量增加的标记，而其他10个为减少的标记。CL程度降低主要针对Ser，Thr或Tyr残基，这些残基对侧链微环境的变化敏感，这种对微环境变化的固有敏感性可以解释为什么观察到CL变化而没有观察到HDX变化的原因。再次验证了45°C热应激下，Ser，Thr和Tyr残基的CL反应性对微环境的变化极为敏感。

图3.热应激（65°C下4 h）利妥昔单抗的DEPC CL / MS和HDX / MS。（A）DEPC CL程度和HDX程度增加。红色表示的残留物表示CL程度增加，而橙色表示的肽表示氘的标记同时增加。显示了残基Lys67和His197的标记程度变化的代表性图。深灰色表示原始状态，而浅灰色表示热应激状态。（B）DEPC CL / MS和HDX / MS减少。蓝色表示的残基表示CL程度增加，而青色表示的肽表示氘的吸收增加。显示了残基Lys74和Thr363的标记程度变化的代表性图。深灰色表示原始状态，而浅灰色表示热应激状态。（C）CH3的放大图两种方法的减少量重叠的区域。（D，E）在65℃加热后，来自利妥昔单抗的HDX / MS图。未加热状态显示为黑色，而热应力状态显示为红色。如果肽段在所有时间点和所有肽段的所有差值的平均值之外3σ，则发现它们在统计学上是不同的。

  总而言之，本文作者团队在此处证明了HDX和DEPC-CL提供了有关单克隆抗体在暴露于热应力下所经历的结构扰动的补充信息，有时还提供了协同作用的信息。鉴于这两种方法的互补性，HDX/MS和CL/MS结合同样适用于研究其他蛋白质治疗剂的HOS扰动。此外，这些方法应适用于表位和对位抗原作图研究和生物仿制药评估，同时提供可改善蛋白质治疗设计的更深层次的结构见解。

撰稿：王雅文

编辑：李惠琳

原文：Complementary Structural Information for Stressed Antibodies from Hydrogen–Deuterium Exchange and Covalent Labeling Mass Spectrometry. Catherine Y. Tremblay, Patanachai Limpikirati, and Richard W. Vachet. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2021 32 (5), 1237-1248. DOI: 10.1021/jasms.1c00072

转载自微信公众号“李惠琳课题组”，改动为撰稿改为我一个人的名字，这篇文章本来就是我一个人写的，只是和同学合作，我写一次她写一次，所以我撰稿会加上她的名字，她撰稿也会加上我的名字，所以在公众号发表时，撰稿人写的两个人的名字。