(请教)怪现象:间接elisa所有孔都阳性
我以自己原核表达并纯化的蛋白不同浓度(10微克/毫升 2.5微克/毫升 0.625微克/毫升)包板4度过夜。1%BSA37度封闭45min.因为没有标准血清对照,而正常成人体内皆有该蛋白抗体,故选择一份正常人血浆(注意用的是血浆)倍比稀释(1:20 ,1:80 ,1:320,1:1280)后加入,HRP羊抗人二抗1:20000稀释。设置两组对照:对照1、未包被抗原的孔(一抗、二抗同其他),对照2、正常包被,但不加一抗(也就是代测血清),而用等体积的封闭液代替。结果:对照2不显色,其他都显色。相同浓度包被的孔随待测血清浓度的下降,od值下降:但代测血清浓度相同而包被不同浓度抗原的孔od值几乎不变,而且对照1的od值与相同代测血清浓度的包被孔也几乎一致。不包被也显色,实在无法理解。
分析与问题:
1、二抗的浓度高了,说明书上建议1:20000-1:40000,是否可以进一步降低浓度
2、是不是代测样品没有使用血清而用了血浆
3、。难道每轮洗3次,每次3分钟还不够?
请大家指点