原代培养按这个做就行了

组织细胞培养技术已被广泛的用于细胞生物学、细胞遗传学、分子遗传学、分子生物学等领域的研究。组织细胞培养技术已被广泛的用于细胞生物学、细胞遗传学、分子遗传学、分子生物学等领域的研究。下面分享关于原代培养的步骤方法。

实验方法原理

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养，由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。

最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。

分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶 (如胰蛋白酶和胶原酶) 消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂 (如 EDTA) 除去细胞互相粘着所依赖的 Ca²⁺，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

实验材料

孕鼠 (胚胎小鼠) 新生 1～3 天乳鼠

试剂、试剂盒

1640 培养液、PBS、胰蛋白酶、EDTA 混合消化液、乙醇

仪器、耗材

手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管、煤气灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜

实验步骤

1. 取材

用颈椎脱位法使胎大鼠迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏，置于无菌平皿中。 

2. 切割

用灭菌的 PBS 液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成 1 mm³ 左右的小块，再用 PBS 清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

3. 消化、接种培养

 吸取 0.25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液 1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37 ℃水浴中消化 8～10 分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入 5～10 ml 含 10％小牛血清的 1640 培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

注意事项

1. 严格进行动物皮肤消毒．使用三套器械取材。新生动物皮肤先用 2％碘酊液消毒，成年鼠先用 3％～5％碘酊液消毒后用 75％乙醇消毒。

2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用 Hank’S 液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。

4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。

整理自：《中国医科大学实验指导手册》《分子生物学实验指导》

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