人肝细胞转染实验操作

正常的原代细胞比肿瘤细胞更能代表体内细胞的功能。利用原代细胞研究相关通路的分子机制是更加可靠的。尽管大多数增殖的、肿瘤来源的细胞系可以通过标准的转染方法(如脂质体转染或聚乙烯亚胺[PEI])轻松转染，但转染原代细胞仍然是一个巨大的挑战。原代人肝细胞(PHH)是临床前药物开发中确定药物代谢、转运和毒性的“金标准”体外模型。

然而，正如非分裂原代细胞都难以转染一样，使用者面临在保持肝细胞分化和特化功能的同时又要达到高效转染的挑战。原代肝细胞对操作和环境变化非常敏感，因此成功转染这些细胞是非常困难的。

为了满足使用Nucleofector电转技术转染人原代肝细胞的需要，在这篇描述了保持细胞功能下的两个电转程序：DS-150和EX-147。

图1. D- Nucleofector^TM System and transfection procedure

用荧光显微镜分别检测pmax GFP^TM质粒DNA和Cleancap mCherry RNA的转染效率；并分析细胞活力、胆汁管形成、白蛋白分泌和CYP3A4、CYP1A2和CYP2B6代谢产物的生成。北京泽平lonza一级代理，微信搜索”泽平科技“进去咨询。

图2. Image of CLF-staining were combined with corresponding pictures of red mCherry fluorescence

使用DS-150程序对DNA的电转效率高达20%，对mRNA的电转效率高达85%，并持续培养7天。在最初的转染后，观察到存活率、白蛋白分泌和CYP3A4活性的轻微下降，在7天的疗程后恢复。转染的PHH形成了复杂的、分支状的胆管网络，并在整个培养过程中保持了良好的形态。

为了达到更高的效率，使用EX-147程序，在转染后24小时DNA转染效率高达68%。然而，随着时间的推移与未转染对照相比，细胞活力和特征性肝功能降低，限制了该项目用于短期研究。

综上所述，对于原代肝细胞，我们开发了“高效DNA程序”和“高功能mRNA程序”,有效的DNA和mRNA表达并保留功能长达7天，从而改善了主要人类肝细胞在药物代谢机制研究中的使用。

Lonza不仅能提供高质量的起始材料，以确保肝细胞的高活性和功能性，也提供温和高效的转染处理过程。

参考文献：

1. Gresch O, Enfel FB, Nesic D, Tran TT, England HM, Hickman ES, et al. New non-viral method for gene transfer into peimary cells. Methods. 2004; 33(2):151-163

2. Mueller-Hartmann H, Faust N, Kazinski M, Kretzschmar T. High-throughput transfection and engineering of primary cells and cultured cell lines-an invaluable tool for reseaech as well as drug development. Expert Opin Drug Discov. 2007;2(11):1453-1465.doi:10.1517/17460441.2.11.1453

3. Zumbansen M, Altrogge LM, Spottke NU, Spicker S, Offizier SM, Domzalski SB, et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. J RNAi Gene Siliencing. 2009;6(1):354-360