构建敲除载体，有个困难，请大神指点，感谢感谢！！！
这个帖子发布于 4 年零 2 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
利用同源重组方法构建敲除载体。要敲除的目的基因，上游取1000bp，用的Ecoi1和Kpn1双酶切；下游取1000bp，用的xbal1和Bamh1双酶切。
刚开始一直先用实验室的pcx62载体连接上游。具体步骤，p上游，纯化，测浓度。双酶切，纯化，最后t4连接酶连接载体，DH5α转化。
结果就是做菌落pcr只有200bp,正常的是1000bp，我想是空载或载体自连。没有得到转化子，搞了很长时间了，一直解决不了。
后来我先构建下游，下游连进去了，上游做菌落pcr还是空载，不知道怎么办了
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 600
回复收藏1
