超微量RNA提取试剂盒
方案1.总RNA超微量提取 该方案适合于微量的培养细胞(1~10000)和动物组织,激光切片,穿刺组织样品中提取总RNA。以下离心条件都必须在室温下进行。
Carrier RNA的用途:若处理小于100µg的动物组织或<1000个细胞时,Carrier RNA须加到RTL Lysis Buffer /β-ME混合液中至终浓度为2ng/µl。
Carrier RNA起着两个作用。首先, Carrier RNA能提高微量的RNA的回收效率;其次是起保护RNA的作用。按Carrier RNA:RTL Lysis Buffer/β-ME =1: 500比例混合。该混合液可在2-8℃稳定放置2天。
举例:
加入2µl Carrier RNA至1ml RTL Lysis Buffer/β-ME中。
Carrier RNA为Poly A,进行反转录时最好不要Oligo(dT)进行反转录,而用随机引物进行反转录。
进行Oligo(dT)进行反转录,可以用酵母tRNA代替Carrier RNA。
收集细胞或组织样品,并彻底去除培养液。加入100 µl RTL Lysis Buffer/β-ME/Carrier RNA至样品中,用移液枪吸打混匀10次。
室温静置5~10分钟。
加入100 µl无水乙醇至裂解液中,用移液枪吸打混匀10次。
把HiPure RNA Nano Column装在2ml收集管中。
转移混合液至柱子中。
6,000 x g离心1分钟。
加入300 µl Buffer RWC(已加乙醇)至柱子中。
6,000 x g离心1分钟。
Buffer RWC在使用之前,须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释。
丢去收集管和滤液。
把RNA柱装在新的收集管中。
按下表配制DNase I反应液,轻轻混匀。
把DNase I反应液加到RNA结合柱的膜中央,室温静置10~15分钟。
DNase I反应液须加入柱子膜中央,不要加到壁上。
加300µl Buffer RWC(已加乙醇)至柱子中,静置5分钟。
6,000 x g离心1分钟。
取出柱子,把滤液重新转移至柱子中。
把柱子装回收集管中。
6,000 x g离心1分钟。
倒弃流出液,把柱子装回收集管。
入500µl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中,6,000 x g离心1分钟。
Buffer RW2在使用之前,须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释。
倒弃流出液,把柱子装回收集管。
入500µl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中,6,000 x g离心1分钟。
倒弃流出液,把柱子装回收集管。
8,000 × g离心空柱3分钟甩干柱子的基质。
将柱子转移至1.5ml离心管中。
打开柱子的盖子,室温放置10分钟以彻底挥发乙醇。
加入5~15µl RNase Free Water至柱子的膜中央。
室温静置1分钟。
8,000 × g离心1分钟。
RNase Free Water中可以加入1U的RNase Inhibitor, 以提高RNA的稳定性。
弃去柱子,把RNA保存于-80ºC。
文献表明,极低浓度的RNA在超低温保存时也会发生降解,建议纯化的RNA要尽快使用。