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超微量RNA提取试剂盒

最后编辑于 2021-05-12 · 来自 Android · IP 安徽安徽
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这个帖子发布于 4 年零 64 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

方案1.总RNA超微量提取 该方案适合于微量的培养细胞(1~10000)和动物组织,激光切片,穿刺组织样品中提取总RNA。以下离心条件都必须在室温下进行。

Carrier RNA的用途:若处理小于100µg的动物组织或<1000个细胞时,Carrier RNA须加到RTL Lysis Buffer /β-ME混合液中至终浓度为2ng/µl。

Carrier RNA起着两个作用。首先, Carrier RNA能提高微量的RNA的回收效率;其次是起保护RNA的作用。按Carrier RNA:RTL Lysis Buffer/β-ME =1: 500比例混合。该混合液可在2-8℃稳定放置2天。

举例:

加入2µl Carrier RNA至1ml RTL Lysis Buffer/β-ME中。

Carrier RNA为Poly A,进行反转录时最好不要Oligo(dT)进行反转录,而用随机引物进行反转录。

进行Oligo(dT)进行反转录,可以用酵母tRNA代替Carrier RNA。

收集细胞或组织样品,并彻底去除培养液。加入100 µl RTL Lysis Buffer/β-ME/Carrier RNA至样品中,用移液枪吸打混匀10次。

室温静置5~10分钟。

加入100 µl无水乙醇至裂解液中,用移液枪吸打混匀10次。

把HiPure RNA Nano Column装在2ml收集管中。

转移混合液至柱子中。

6,000 x g离心1分钟。

加入300 µl Buffer RWC(已加乙醇)至柱子中。

6,000 x g离心1分钟。

Buffer RWC在使用之前,须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释。

丢去收集管和滤液。

把RNA柱装在新的收集管中。

按下表配制DNase I反应液,轻轻混匀。

把DNase I反应液加到RNA结合柱的膜中央,室温静置10~15分钟。

DNase I反应液须加入柱子膜中央,不要加到壁上。

加300µl Buffer RWC(已加乙醇)至柱子中,静置5分钟。

6,000 x g离心1分钟。

取出柱子,把滤液重新转移至柱子中。

把柱子装回收集管中。

6,000 x g离心1分钟。

倒弃流出液,把柱子装回收集管。

入500µl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中,6,000 x g离心1分钟。

Buffer RW2在使用之前,须按瓶子标签指示加入无水乙醇进行稀释。

倒弃流出液,把柱子装回收集管。

入500µl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中,6,000 x g离心1分钟。

倒弃流出液,把柱子装回收集管。

8,000 × g离心空柱3分钟甩干柱子的基质。

将柱子转移至1.5ml离心管中。

打开柱子的盖子,室温放置10分钟以彻底挥发乙醇。

加入5~15µl RNase Free Water至柱子的膜中央。

室温静置1分钟。

8,000 × g离心1分钟。

RNase Free Water中可以加入1U的RNase Inhibitor, 以提高RNA的稳定性。

弃去柱子,把RNA保存于-80ºC。

文献表明,极低浓度的RNA在超低温保存时也会发生降解,建议纯化的RNA要尽快使用。

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