影响胚胎发育的耗材毒性问题，生产商是如何测试呢？

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研究问题：IVF耗材培养液生产商是如何进行胚胎毒性检测呢？

在IVF实验室日常操作中，除了认真负责的胚胎师之外，实验室质控是影响胚胎发育质量的重要part。有文献指出在受精率降低或胚胎发育异常的情况下，应怀疑胚胎毒性。而在国内目前实验室而言，针对每一批培养液和耗材进行鼠胚或精子存活实验是不现实的。比如像笔者所在的小中心，周期量较小，首先是没有动物中心配合做鼠胚，其次是没有足够人手来做精子存活实验。为了保障实验室质控，我们所使用的培养液耗材均来自进口产品。这里使用进口产品主要是考虑到1.进口产品价格虽然高但是产品质量好，如培养皿或冷冻载杆显微镜下杂质出现几率小。2.进口产品有相对较好的品牌背书，一旦出现问题能得到妥善解决。从这里也可以看出国产品牌努力的空间仍然比较大。

  笔者曾经参与过国内某产品的设计，发现困扰我国耗材产品难点在于以下几点：1.产品设计重在模仿，创新能力太弱。不论是培养皿、液或其他耗材重在模仿龙头产品，或者稍加修改。2.虽然国产价格相比进口下降，可是原材料来源质量和成品质量却无法保障。面对囊胚形成率这个关键问题，国内大部分中心在选择时耗材，未免谨慎再谨慎！

文章总结提前看：看完这篇文献，不免觉得之前我们对于“国外的月亮更圆”带了些许误会。原来IVF实验室耗材其实质控也并非我们想象的如此严格。

 以上谈了几句体外之话，咱们还是回过头来看文献。

Embryotoxicity testing of IVF disposables: how do manufacturers test?

L Delaroche 1 2, P Oger 1, E Genauzeau 1 2, P Meicler 1, F Lamazou 1, C Dupont 3, P Humaidan 4 5

Hum Reprod. 2020 Feb 29;35(2):283-292. doi: 10.1093/humrep/dez277.

PMID: 32053198

这个文献是一个来自法国与丹麦科学家合作的文献，在2018年11至12月期间，他们设计关于鼠胚和精子存活实验的调查问卷发给了22个试剂生产厂商。其中有11个厂商回复了他们信息。下面是问卷信息汇总

表1总结了这些公司是否做鼠胚实验。在这参与问答的11家公司中，有9家做鼠胚实验。但是鼠胚实验方法不是必需相同。其中一家公司会分包实验，主要根据实验室当地的气候环境。其他的无分包情况。当分包是，这些实验需要通过ISO17025标准和非临床实验室研究的良好实验室规范，联邦法规第21篇第58部分测试认证计划。

两家公司对原材料和最终产品都进行了MEA（鼠胚实验），九家公司只对成品进行了MEA。MEA实验是在已经包装和灭菌完毕的产品上进行的，没有预阶段“通风透气”，除了一家公司在MEA测试前打开包装并让它们整夜通风。每批测试的数量因公司和消耗品类型而异，从每批1个到10个不等，一家公司每3批测试10个项目。

鼠胚来源：六个制造商使用来自小鼠近交系B6C3F1xB6D2F1的杂交体进行了MEA测试。一家公司使用系株B6/CBA，另一家公司使用鼠株FVB/NxCD1。对于另外两家公司，根据测试项目和要求的特异性，使用了几种不同的小鼠品种。

鼠胚数量最少为15枚，有时增加到30或31枚。所有公司在做MEA时都设置实验组与对照组。但是实验组和对照组的胚胎数量可能不一致。8家公司使用1细胞胚胎，剩下3家公司使用2细胞胚胎。大部分胚胎为鲜胚或偶然为大部分冻胚加少部分鲜胚。

培养基和培养

8家公司使用人类IVF培养基啊，2家公司使用鼠胚培养基。鼠胚实验为成批测试。2,3,5,7或21胚胎在一个皿里或单滴培养，培养基量在从12.5微升到1毫升不等。培养环境通常在37±1°在5±1%CO2中培养。没有在低氧环境中进行鼠胚实验。只有1家公司检测实验室空气质量，两家公司回复没有检测实验室空气；其他公司拒绝回答这个问题。

鼠胚标准

各个公司的标准不同。三家公司的囊胚形成率界定点96小时培养后为75%或80%。6家公司增加了形态学评估，囊胚形成率界定标准为72或96小时70%或80%。两家公司使用24小时卵裂率80%与96小时囊胚形成率80%，或120小时囊胚孵出率80%。此外，一些公司记录了测试组和对照组之间的形态学差异。三家公司通过荧光显微镜对从MEA获得的所有胚泡进行了细胞计数，每个胚泡获得的细胞数量不应与对照组有显著差异。

HSSA

表三概述了HSSA的调查结果。与MEA实验不同的是，HSSA协定并没有系统地适用于所有用于体外受精的消耗品，而是只适用于与精子直接接触的物品，如授精导管、血清移液管和一些培养皿。由于缺乏标准化和测试认证，一家制造商没有进行HSSA测试。六家公司将测试分包出去。然而，所使用的方法和目标不一定相似。通常，每批测试一个项目，如果第一次测试为阴性，则对第二个项目进行重新测试。

精子和孵育

主要使用新鲜的供体精子；然而，所用精子的初始和最终浓度很少被描述。同样地，精子制备方案很少被描述，通常是梯度或上行处理。使用的孵育温度是32或37℃，精子制剂有时在不同类型的培养基中在5% CO2下孵育。

对于MSA，由于HSSA实验方案不同，在这里对授精导管举例，表2。

一些制造商主要在孵育24小时后评估总运动性，其他制造商评估进行性运动性或两者兼有。一家公司在孵育48和72小时后测量了运动性。另一家公司记录了0、4、8和24小时的运动，但使用8小时点作为阈值。大多数公司使用人工计数法(Maker精子计数板，最少100或200个精子)，而一家公司使用自动计数法。其他人没有详细说明他们的计数技术。

HSSA的目标和标准

HSSA的目标和标准因公司而异。大多数公司在孵育24小时后精子精子活力指数（SMI）为70%或75%。一家制造商在孵育2小时和24小时后记录了运动性，并预计SMI >75%。另一家公司的标准目标是在孵育后8小时大于72%，最后，对于一家公司，在培养后24、48和72小时内，试验组的标准应大于70%，对照组的标准应大于75%。

 讨论

本研究显示了制造商使用的多种协定和HSSA的方法和目标的显著差异，以确认他们的ivf耗材中不存在毒性。作为一种小鼠测试，不同的制造商使用的小鼠品系(远缘、近交或杂交)、胚胎的数量和来源(新鲜的或解冻的)以及它们的阶段(单细胞或双细胞)各不相同。重要的是，这些参数会影响测试的灵敏度。特别是，每组使用的胚胎数量从15个到31个不等，试验组和对照组之间的数量存在差异。在这方面，蓬特凡·德·扎勒姆等人观察到至少有69个胚胎才可以达到检测毒性的灵敏性。在我们的调查中，我们无法揭示胚胎是否以及如何被随机化分配，尽管这一点很重要，因为小鼠之间和小鼠内部存在差异。同样，不同培养条件(补充蛋白质、胚胎密度、油、缺氧...)不同公司的要去各不相同，尽管它们可能会影响结果。举例来说，像白蛋白这样的蛋白质可能会使结果产生偏差，因为它们可以螯合毒素。

我们对HSSA的观察与MSA的观察没有什么不同，不同公司之间在阈值、温度和孵化时间方面存在差异。此外，供体精子的来源(新鲜的或解冻的)、精子参.(浓度)和精子制备技术以及培养基大多是未知的。然而，所有这些参数都影响HSSA结果。另外一个HSSA的缺点是，每个检测产品的大部分精子都来自一个供体精子样本，因此对检测差异都比较敏感。在未来的法规中，应描述经过统计验证的样本数量。

尽管供应商进行了生物测定测试，试管婴儿实验室的供应质量仍会出现波动，这表明目前的毒性筛选程序可能存在缺陷(Morbeck，2012年)。事实上，尼伊斯等人观察到，8%的体外受精设备被发现存在潜在的胚胎毒性。

本研究的一个限制是参与公司的数量和相当低的回复率(11/21)。然而，在研究过程中，我们尽最大努力通过与公司的反复接触来提高回复率，很明显，有相当多的人不愿意回答涉及公司微妙问题的问卷。相比之下，这项研究的优势在于，我们联系了试管婴儿领域的主要公司——如果他们没有回应，我们会多次尝试联系他们。虽然答复率很低，但我们认为，目前的结果描述了胚胎毒性测试的现状，缺乏标准化和监管，透明度非常低。

重要的是，我们的研究证实了制造商在验证其IVF实验室一次性用品时进行的胚胎毒性测试的异质性。试管婴儿实验室中使用的设备和介质的毒性测试“规程”目前发展不佳，这使得制造商和监管机构选择“最佳实践”的证据有限。之前已经强调了测试的灵敏度问题(塔克和詹森，2002年，韦策塞特等人，2010年)，建议和标准化显然需要随着时间的推移提高灵敏度和再现性。一些公司意识到胚胎毒性测试的弱点，已经开发了基于新技术的替代测试来提高灵敏度(安斯沃思等人，2017年，吉尔伯特等人，2016年，美斯特雷斯等人，2019年，沃尔夫等人，2013年)，美国FDA和UE概念指南正在就此主题进行研究(辅助生殖技术设备的小鼠胚胎分析，行业和食品及药物管理局工作人员指南草案)。否则，制造商在这一重要问题上提供的信息相当贫乏，从我们的分析中可以清楚地看出，在试管婴儿一次性用品的胚胎毒性测试领域，迫切需要监管和透明度。商业文化媒体也存在这种透明度问题，虽然不同品牌似乎会导致出生体重(Kleijkers等人，2016年)和儿童体重(Zandstra等人，2018年)的差异，但其组成并未完全向用户披露。总之，在这项基于问卷的研究中，试管婴儿一次性用品毒性试验的方法和目标存在显著差异；虽然答复率相当低，但结果很可能描述了目前的状况。在这种情况下，等待毒性测试的监管改进，我们建议试管婴儿实验室在使用前重新测试关键产品，作为其质量管理计划的一部分。

最后参与调查问卷的公司有：

Jeff Lascher (Cook Medical), Magdalena

Depa-Martinow (Cook Medical), Nadia Touamine (Cook Medical),

Isabelle Lorenzatto (Vitrolife), Hubert Joris (Vitrolife), Sophie Jolly

(CooperSurgical), Xavier Buchon (CooperSurgical), Mylène Santos

(CooperSurgical), Isabelle Calais (CooperSurgical), Patrick Choay

(CCD), Patrick Bouveret (CCD), Mohamed Bidri (CCD), Florence

Vullierme (CCD), Bernard Montanari (ElliosBioTek), Catherine

Broberg (E.in.Art), Will Veen (WillcoWells), Marie Josée Ze-Bissemou(ThermoFischer Scientific), Raquel Matos (Corning Life Science),

Vincent Yang (Sunlight Medical), Julio Piedra (Kitazato Dibimed),

Yannick Feirrera (Merck Serono), Becca Swan (Gynetics), Michelle

Tedder (EmbryoTech), Melissa Alfaro (EmbryoTech), Layla El Younani

(JCD),JeanLouisPrevost(JCD),DanielSchnitzer(Biocare),JeanLouis

Spach (Biocare), Cécile Sudon (Biocare), Alice de Ligniville (Charles

River) and Benoit Remy (GIGA).

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