质粒转染制备稳定细胞系

最近几个月时间做了三株细胞的过表达稳转株建立，原来稳转株建立主要是采用慢病毒来做，但这三株是采用质粒顺转之后做，和慢病毒方法还是有些不同的，在此分享下自己的所得。

材料

1、肿瘤细胞株：4T1 10%RPMI-1640； EMT6 10%RPMI-1640 Waymouth's MB 752/1 Medium + 2mM L-glutamine；MC38 10%DMEM(热灭活)。

2、转染质粒：pcDNA 3.1 CMV-Target gene-IRES-EGFP-bGH polyA-SV40 P-NEO-SV40 polyA。

3、转染试剂：贴出来就相当于打广告了， 类似于lipo 2000。

方法

第一步转染：和所有转染方法一致，无区别，不做细述。只说下数量 6孔板的一个孔70%的细胞密度。

第二步单克隆铺板：转染结束后24h就可以进行铺板单克隆筛选，不同于慢病毒方法。质粒转染后整合至宿主细胞基因组的效率太低，所以我们要将全部的转染细胞用于铺板10cm盘，细胞密度控制要低约5%，细胞一定要是单个独立存在。慢病毒的话是感染后药筛存活的多克隆取少量细胞进行梯度稀释96孔版筛选。

第三步单克隆筛选：转染结束后48h，就可以进行加药筛选。建议第一轮药筛浓度控制在1/2左右；第二轮药筛 依据细胞状态而定，每个细胞的性状都是不同的，很难定，但药一定要给，不能完全不给。后续几轮持续给药在观察到有阳性单克隆后可以加大给药量至1/2以上，直至单克隆完全形成，可以被挑选出。单克隆形成一般就2周左右，依据具体实验而定。中间克隆正在形成的图片：

第四步单克隆扩增：从10cm挑取单克隆步骤实在是不好描述，如果大家有想了解，我门再说，总之尽量避免状态差的克隆和距离很接近的克隆。挑取后的单克隆分别经历96孔板—24孔板——6孔板——10cm盘的扩增，再96孔板的时候因为克隆刚被挑选出来细胞的状态很受影响，可以降低药物浓度至1/4以下。从第一步到这里一般需要2个月时间。具体因细胞而定。

第五步检测和入库：检测因为课题要求只采用了荧光阳性即可，所以荧光阳性克隆就直接入库了。当然也进行了些qPCR检测目的基因。WB因为课题不需要就没有进行。最后一定要进行支原体检测，否则一切都是白浪费功夫。附下成功克隆的图片：

最后总结下需要注意的地方：

1、MC38 密度高细胞立刻就变形甚至死亡；4T1和EMT6增殖速度很快，所以需要注意转染至单克隆铺板细胞密度的把控，防止细胞变形。其中4T1对NEOmycin很敏感，但是浓度低了细胞不会死，疯长之后就很难杀死，浓度高了阳性克隆也会死，所以做这个细胞的时候多准备些克隆筛选盘，梯度给药。

2、转染条件：在正式进行实验前，最好摸索转染试剂和质粒、细胞密度的比列问题，谋求最好的转染条件。

3、一定要有耐心，一定要在判断如何给药的时候明确目标就是阳性克隆存活和非阳性克隆的死亡。三个细胞的转染效率是真低。

这好像说到最后变成了汇报的帖子了，希望能够对马上从事相关课题的同志们有帮助，也希望能和大家交流学习。