请教PEDV分离的经验

本渣目前在做PEDV的分离，但是两个月来没有什么收获，病料是17年采集的现在才开始分毒，感觉是分离不出来最近收集了今年十月采集的病料打算重新开始。目前实在Vero细胞上分毒的。步骤首先是制作病毒液，用匀浆仪研磨病料后1：5加入MEM和双抗，离心后取上清置于四度过夜浸毒。第二天早上接毒，取长好的Vero细胞加入2ml病毒液和终浓度5mg/ul 胰酶（纯胰酶，不含EDTA和酚红），孵育两小时后弃去病毒液PBS洗三遍后加入7ml维持液（胰酶终浓度5mg/ul 的MEM）。每天观察是否病变。

遇到的问题：1 没有观察到典型病变 2 rt-pcr没有条带（现在设计了引物准备用荧光定量PCR去验证）3 不知道到底该用哪种胰酶，是否含EDTA 4 胰酶终浓度的选择 5 未接毒的VERO细胞形态有点和网上的不一样不知道是怎么回事（附图） 6 不知道是否在实验步骤上有问题

希望能得到大家的帮助，万分感激，后期如果我成功分离病毒会整理出一套适合的方法发帖！